富血小板血漿對兔腰背根神經節細胞凋亡的影響

董晤訊，馬勇，郭楊，朱愛洪，朱亞亮，黃浩，于輝，于暉曜

作者單位：1南京中醫藥大學第一臨床醫學院骨傷研究所，江蘇 南京210023；2常州市金壇區中醫醫院骨傷科，江蘇 常州213200

腰椎間盤突出癥是臨床上極為常見的疾病，其發病率較高[1]。近幾年，富血小板血漿（Platelet Rich Plasma，PRP）用于組織再生與修復已經被臨床醫生和科研人員廣泛采用，主要包括組織再生和組織修復[2]。PRP是從全血中提取出來的血小板濃縮液，含有高濃度的血小板。而每個成型血小板中含有超過30種生物活性蛋白，其中大多數在組織修復中起基礎作用[3]。研究表明，機械性壓迫與炎癥化學性刺激是腰椎間盤突出后引起腰脊神經根病理生理變化的重要原因[4]。本研究將兔自體髓核組織移植于腰背根神經并結扎神經根，制作兔腰背根神經機械性壓迫、炎性損傷動物模型，該模型除了能產生機械壓迫及脊神經根缺血的病理改變外，還能通過自體髓核移植產生大量炎性因子，刺激神經根，能較穩定、長久地產生神經痛樣的改變，能較好地模擬人類腰椎間盤突出癥的發病機制。建模后觀察自體PRP干預后腰背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）組織學形態及細胞凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 研究時間為2017年10月至2018年2月，實驗動物為健康新西蘭兔48只，雌雄各半，體質量范圍為1.5～2.0 kg，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供并飼養（動物合格證號：201720320）。所有兔均分籠，適應性飼養1周，每日供應足量食物和水，定期更換托盤墊料、消毒和通風。飼養室溫度維持在20～25℃，濕度50%～80%，模擬晝夜照明。所有實驗操作步驟均輕柔，避免過度刺激實驗兔引起緊張。將實驗兔按隨機數字表法分為治療組、對照組、假手術組，每組16只。其中造模術后由于失血過多死亡6只，依次補齊后進行實驗。本研究符合一般動物試驗倫理學要求。

HE染色試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（顯色法）（上海碧云天生物技術有限公司）；凝血酶（Sigma公司，美國）；抗凝劑枸櫞酸鈉（南京中醫藥大學實驗中心）。高速冷凍離心機（德國Eppendorf）；Image Pro Plus 6.0圖像分析系統（Media Cybernetics公司，美國）。

1.2 PRP制備 使用10 mL無菌注射器，吸取20%枸櫞酸鈉潤管，抽取治療組耳中動脈血約8 mL，其中2 mL用于血小板計數，剩余6 mL置入含有枸櫞酸鈉抗凝劑的離心管內用于制備PRP。根據Aghaloo二次離心法，首先以215 g離心10 min，吸取白膜層以上血漿置入另一離心管內進行二次離心，以863 g離心10 min，去除上清，留取下層約0.8 mL液體搖勻，即為PRP。取0.2 mL PRP用于血小板計數，剩余0.6 mL PRP中加入0.06 mL凝血酶（濃度1 000 U/mL，溶劑為10%氯化鈣），激活PRP以凝集成膠狀。

1.3 模型制備及實驗方法［5］實驗新西蘭兔采用耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉，按1 mL/kg麻醉，麻醉成功后，將兔俯臥位固定，常規碘伏消毒，鋪無菌洞巾。以腰4棘突旁開1 mm為中點，順棘突方向切開，切口約長4 cm，沿棘突右側剝離髂棘肌并向一側分開。咬除L4、L5右側椎板、關節突和部分椎弓根。顯露右側硬脊膜及L4的右側神經根。假手術組不作干預，治療組與對照組采用4-0鉻制腸線環扎L4背根神經，松緊度以背根神經略受壓變形為度。截斷兔尾，取一個椎間盤的髓核，將其移植到右側L4神經節周圍。行相應治療后縫合切口。

1.4 治療及觀察方法 治療組兔模型將凝膠狀PRP置于DRG周圍后縫合切口，對照組兔模型則置入等體積自體脂肪后縫合切口，假手術組不作干預縫合切口。術后3組兔均肌內注射青霉素40萬U抗炎治療。術后分別于24、48、72、96 h 取DRG，HE 染色觀察組織學形態，TUNEL法染色，鏡下觀察并計算陽性細胞數。

1.5 觀察指標

1.5.1 DRG組織形態學觀察 測定機械刺激痛閾值后，將3組兔取出的右L4 DRG以生理鹽水沖洗后，投入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，以備制作光鏡標本。病理組織切片按常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，HE染色、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察各組織形態學變化。

1.5.2 TUNEL染色觀察DRG細胞凋亡 ①將3組DRG石蠟切片常規脫蠟、復水。②滴加3%過氧化氫1 mL，阻斷內源性辣根過氧化物酶。③滴加0.1%TritonX-100使細胞膜的通透性增加。④PBS、雙蒸餾水沖洗。⑤標記：滴加TUNEL反應混合液50微升/片。⑥信號轉化和分析：加入轉化劑-POD（酶標記抗熒光素抗體）、DAB、蘇木精復染、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察3組兔DRG細胞凋亡率，分析結果，陽性細胞細胞核為棕黃色。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件包處理數據結果。計量資料用表示，多組多時點比較采用兩因素重復測量方差分析，組間精細比較為LSD-t檢驗，時間精細比較為差值t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血小板計數 兔耳中動脈血中血小板計數為（191.93±12.50）×109/L。 PRP 中 血 小 板 計 數 為（879.06±24.70）×109/L，約為外周血的4.59倍，達有效治療濃度標準。

2.2 組織形態學觀察 各組兔于術后各時間點麻醉后，暴露結扎的DRG。術后24 h、48 h肉眼見DRG輕度水腫，與周圍組織無粘連。術后72 h、96 h肉眼觀察對照組可見DRG水腫，與周圍組織粘連；治療組DRG水腫程度較低，與周圍組織無粘連，可輕易游離DRG；假手術組未見DRG水腫。術后96 h HE染色：可見對照組、治療組細胞排列規則，細胞間隙無明顯增寬；對照組神經元皺縮，排列欠規則，細胞間隙寬，尼氏小體變少，細胞核縮小；假手術組無明顯病理變化。

2.3 TUNEL染色觀察DRG細胞凋亡 治療組四個時間點，TUNEL陽性細胞數均低于對照組（P＜0.05）；對照組術后隨時間延長TUNEL陽性細胞數逐漸增加（P＜0.05）；治療組與假手術組相比，在各個時間點陽性細胞數差異有統計學意義（P＜0.05）。假手術組與對照組相比，各時間點陽性細胞數均差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 三組兔富血小板血漿對腰背根神經節細胞凋亡的影響/（個，）

表1 三組兔富血小板血漿對腰背根神經節細胞凋亡的影響/（個，）

注：與假手術組同時點比較，aP＜0.05，與對照組同時點比較，bP＜0.05；與組內24 h比較，cP＜0.05

images/BZ_111_238_1663_1192_1725.png對照組治療組假手術組整體分析（HF系數）組間F值，P值時間F值，P值交互F值，P值16 16 16 21.93±2.44a 9.09±1.39ab 5.36±1.05 24.34±3.82ac 12.32±0.85abc 5.27±1.22 23.83±3.30ac 14.55±0.79abc 4.20±0.46c 27.45±1.44ac 15.29±0.98abc 4.98±0.72 0.8894 3，401.938，0.000 29.011，0.000 12.385，0.000

3 討論

細胞凋亡是由基因控制的一種程序性死亡過程，這一過程涉及有多個基因及神經生長因子的參與[6-10]。有研究發現脊神經根受損后，可出現長達數月的神經元凋亡[11-12]。腰椎間盤突出壓迫造成神經根損傷，可引起DRG內細胞凋亡。本研究通過對兔背根神經結扎加自體髓核移植，對神經根產生機械性壓迫。同時破裂的髓核釋放的化學性物質作用于神經根產生炎癥反應[13]，造成神經根損傷。在本研究各時間點中，對照組DRG中細胞凋亡率明顯高于假手術組（P＜0.05），表明該模型可以誘導DRG的神經元凋亡。

PRP療法已經成為增強組織修復和再生的潛在方法，其臨床應用已經擴展到口腔科、皮膚科、眼科、骨科和運動醫學等專業領域。一項PRP聯合同種異體骨移植治療骨缺損的隨機臨床對照試驗展現了PRP在組織修復方面的能力[14]。PRP中富含高濃度血小板，通過氯化鈣及凝血酶激活后可釋放多種生長因子，其活性可持續5～8 d[15]。有研究表明，PRP中肝細胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）參與抗炎癥過程[16]，HGF可特異性抑制E-選擇素，進而誘導抗炎細胞因子[17]；此外，HGF可通過抑制NF-κB通路的活化，來降低促炎細胞因子TNF-α基因的轉錄[18]。在小鼠皮瓣缺血再灌注損傷實驗中，PRP可以抑制NF-κB通路及TNF-α的表達[19]。在對坐骨神經損傷的研究中，發現PRP可增強周圍神經修復能力，可能與PRP中的生長因子參與了神經再生過程有關[20]。在另一項研究中，發現PRP可降低Bax基因表達，進而抑制凋亡[21]。有研究表明PRP可促進神經生長因子（Nerve Growth Factor，NGF）表達，這對背根神經節修復具有重要意義[22]。本研究發現，對照組TUNEL陽性細胞數明顯高于治療組與假手術組（P＜0.05），提示自體PRP可以明顯抑制DRG神經元凋亡。

據上所述，本研究結果表明，在兔神經根壓迫及炎癥模型中，使用自體PRP治療后，可顯著降低術后96 h DRG細胞凋亡率，抑制細胞凋亡，對神經元具有保護作用，未來通過進一步研究，可能為椎間盤突出癥病人的治療提供新的選擇。