熒光PCR探針熔解曲線技術檢測MTB耐藥性的成本分析

宋怡蒙 李遠春 賀文從 何萍 包晶晶 劉春法 劉東鑫 王鑫洋 趙雁林 李燕明

耐藥結核病患者的早期、快速、準確診斷是有效治療的前提，也是結核病防控的關鍵環節。目前，我國最常用的MTB藥品敏感性(簡稱“藥敏”)檢測方法為比例法固體藥敏法，然而由于MTB生長緩慢，傳統藥敏試驗耗時較長，需要3～8周的時間，很難及時指導臨床治療，亟需一種快速、準確、簡單、廉價的藥敏試驗方法來檢測MTB的耐藥性[1-2]。

以往研究表明，與分子生物學方法相關的診斷成本過高，可能會成為限制其在基層結核病防治單位推廣使用的重要因素[3]。目前尚缺乏有關傳統藥敏和熔解曲線技術檢測成本分析的相關報道。本研究通過對BACTEC MGIT 960技術(簡稱“MGIT 960”)和熒光PCR探針熔解曲線技術(簡稱“熔解曲線技術”)進行MTB耐藥性檢測成本的比較，評估熔解曲線技術在我國不同地區、不同層級結核病專科醫院和綜合醫院進行實驗室應用的可行性。

資料和方法

一、研究現場

綜合考慮不同醫療機構地域分布情況、醫療機構的性質和級別，選擇具有全國代表性的醫療機構聯合開展本次研究。最終選取西安、烏魯木齊、沈陽、南陽、遵義和杭州6個項目地點，以西安市胸科醫院、新疆維吾爾自治區胸科醫院、沈陽市胸科醫院、南陽市第六人民醫院、遵義醫學院附屬醫院和杭州市紅十字會醫院等6家結核病定點醫院作為研究現場，于2018年10—12月開展成本數據收集。

二、研究方法

1. MGIT 960：采用美國BD公司生產的BACTEC MGIT 960培養箱、液體培養和藥敏試驗管進行分析。試劑配制、培養及藥敏操作嚴格遵照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[4]、《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》[5]中的標準化操作程序進行操作。

2. 熔解曲線技術：將1 ml通過2%NaOH溶液處理過的標本應用半自動核酸提取儀(型號：Lab-Aid 824；廈門致善生物科技股份有限公司)提取核酸。根據廈門致善生物科技股份有限公司提供的標準化操作流程配制PCR反應體系，將5 μl提取后的核酸加入20 μl的PCR反應液中進行擴增。對于RFP、INH和二線注射類抗結核藥品，分A、B兩個體系進行檢測，每個體系分別有FAM和TET通道，共4個通道對耐藥核心區進行檢測。對于氟喹諾酮類藥品，采用單個體系一個通道進行耐藥性檢測。通過比較檢測樣本與陽性對照之間熔解曲線熔點(Tm)的差異判斷是否發生突變。

3. “要素法”成本分析：熔解曲線技術和MGIT 960耐藥性檢測的成本參考文獻[6]，通過要素法進行估算。收集不同檢測過程(從實驗室接收標本到報告結果和廢棄物處理等)所有直接和間接成本，涉及以下幾方面要素[7]：(1)基本投入成本：分別收集各實施單位的基本投入成本，包括實驗室房屋面積、辦公區房屋面積、實驗室建設改造費用等，考慮房屋的使用年限，折算房屋單位時間費用；(2)實驗室儀器設備成本：所有實驗設備的成本均以采購新的價格來計算，且該成本應包括所有的采購相關費用，如運輸、安裝等；收集主要設備的年度維護/維修成本，根據儀器的使用年限，折算儀器單位時間成本；(3)實驗室管理成本：實驗室水費、電費、垃圾處理費、暖氣費等；(4)人員成本：實驗室人員工資，包括支付給員工所有獎金和補助；(5)耗材成本：包括手套、實驗服、帽子、常規試劑等耗材單價。

在不同工作量下完成試驗的時間，包括人工時間和各種儀器使用時間，因工作量的不同，有些步驟所耗費的時間并非等比例增長。故本次研究中每個實驗室根據當地日工作量的不同，分別在日工作量高、中、低的時間記錄3次，收集MGIT 960和熔解曲線技術檢測過程中的全部時間、儀器使用時間、試劑消耗及耗材數量等情況，如實將各部分情況記入統計表格中，最后取其均值。各要素的成本=試驗過程中使用的各要素的數量×各要素的單位價格。其中，資本性費用如實驗室空間、建筑物和設備等，其單位價格根據其采購價格和預計的使用年限按照年度折算；管理費用的計算根據實驗室工作人員數量、人員工作時間和其他與該系統相關的基礎設施、建筑物的使用狀況，將相關費用分配到各次檢測中。將上述收集的成本數據錄入Word中，作為不同實施醫院的基礎數據。熔解曲線試劑的價格采用項目采購價格，每種藥品按照3680元/48人份進行計算，按每次共檢測4種藥品計算，MGIT 960檢測及其他相關耗材的價格采用目前市場調查的價格。

4. 質量控制：收集各項成本數據時，規范各單位3種方法的實驗步驟，使其一致；收集熔解曲線技術、MGIT 960檢測整個過程所有的直接和間接成本，由雙人同時錄入Word和Excel中，并經一致性檢查修正錯誤，建立數據庫。

5. 統計學處理：采用Word 2013和Excel 2013軟件進行數據錄入和統計。計數資料采用“率(%)”或“構成比(%)”表示。

結 果

一、MGIT 960檢測的平均單位成本

采用MGIT 960技術，對每例患者進行MGIT 960的平均檢測成本為702.6元。試劑費、管理費和耗材費的成本占總成本的比例較高，分別占76.5%(537.6/702.6)、8.6%(60.7/702.6)和6.0%(42.1/702.6)，而建筑費和設備費的成本所占比例較低，分別占2.2%(15.2/702.6)和1.4%(9.8/702.6)。在6個項目地點中，烏魯木齊的成本最高，為734.3元，其耗材費和設備費較其他5個地區高。南陽的成本最低，為643.3元(表1)。

二、熔解曲線技術的平均單位成本

使用熔解曲線技術對每例患者進行MTB耐藥性檢測的平均單位成本為440.7元。試劑成本占總成本的構成比最高，達到88.8%(391.2/440.7)。管理費、耗材費和人員費成本相似，分別占4.1%(18.2/440.7)、4.1%(18.2/440.7)和2.6%(11.3/440.7)，而建筑費和設備費占比最少，兩者相加僅占總成本的0.4%[(0.1+1.7)/440.7]。在6個項目地點中，烏魯木齊的總成本最高，為447.5元；西安的總成本最低，為433.2元(表2)。使用熔解曲線技術進行MTB耐藥性檢測的成本較MGIT 960耐藥性檢測低261.9元。

三、熔解曲線技術與MGIT 960檢出1例MDR-TB患者的平均成本

由于各項目點進行耐藥MTB檢測的單位成本不同，且由于可疑結核病人群中MDR-TB患病率不同及不同檢測方法檢出率的差異，各地檢出1例MDR-TB患者的平均成本也不同。本研究以MGIT 960每人每次檢測5種藥品耐藥情況的成本和熔解曲線技術每人每次檢測4種藥品耐藥情況的成本進行分析，分析使用熔解曲線技術、MGIT 960檢出1例MDR-TB患者的平均成本(表3)。本研究采用本次重大專項項目所得出的各地MDR-TB檢出率進行計算，使用MGIT 960從MTB培養陽性的患者中檢出1例MDR-TB患者的平均成本為5404.6元。其中以南陽的成本最高，為17 869.4元；遵義的成本最低，為4063.8元。使用熔解曲線技術檢出1例MDR-TB患者的平均成本為3364.1元，其平均成本低于MGIT 960法。其中以南陽的成本最高，為10 690.2元；沈陽的成本最低，為2259.4元。

表1 MGIT 960耐藥性檢測的平均單位成本(元)

注采用“要素法”進行成本計算分析；管理費=(月物業費+安保費等管理費用)×試驗全部過程所需時間/月法定工作時間/標本例數；建筑費=大樓建設成本×完成該試驗實驗室面積/大樓面積；設備費=所使用儀器購買價格×用于該試驗過程中的使用時間/預期設備使用壽命/標本例數；人員費=實驗室人員的月平均工資×完成試驗人數×試驗全部過程所需時間/月法定工作時間/標本例數；試劑費=試劑單價×試驗所用個數/標本例數(或試劑單價×試驗用量/試劑總量/標本例數)；耗材費=單價×試驗所用個數/標本例數(或單價×試驗用量/總數量/標本例數)；各個研究點的單位成本=管理費+建筑費+設備費+人員費+試劑費+耗材費；平均單位成本=各研究點單位成本的總和/研究點數量

表2 熔解曲線技術對MTB耐藥性檢測的平均單位成本(元)

注采用“要素法”進行成本計算分析；管理費=(月物業費+安保費等管理費用)×試驗全部過程所需時間/月法定工作時間/標本例數；建筑費=大樓建設成本×完成該試驗實驗室面積/大樓面積；設備費=所使用儀器購買價格×用于該試驗過程中的使用時間/預期設備使用壽命/標本例數；人員費=實驗室人員的月平均工資×完成試驗人數×試驗全部過程所需時間/月法定工作時間/標本例數；試劑費=試劑單價×試驗所用個數/標本例數(或試劑單價×試驗用量/試劑總量/標本例數)；耗材費=單價×試驗所用個數/標本例數(或單價×試驗用量/總數量/標本例數)；各個研究點的單位成本=管理費+建筑費+設備費+人員費+試劑費+耗材費；平均單位成本=各研究點單位成本的總和/研究點數量

表3 不同項目地區分別使用熔解曲線技術和MGIT 960檢出1例MDR-TB患者的平均成本

注此表價格為測算數據；單位成本為檢測每例患者的平均單位成本(見表1和表2)；檢出MDR-TB成本=單位成本/檢出率

四、診斷單例MDR-TB患者的費用

MDR-TB的患病率直接影響診斷疾病的成本。同樣，診斷方法的敏感度也會影響成本。本研究采用MGIT 960檢測結果作為參考標準，分析MGIT 960和熔解曲線技術診斷單例MDR-TB患者的成本。在MDR-TB患病率不同的可疑人群中，不同敏感度的檢測方法檢出1例MDR-TB患者的平均成本計算方法為：平均成本=平均單位成本/患病率×敏感度。如表4所示，當結核病患者中MDR-TB患病率越高，應用MGIT 960、熔解曲線技術檢出1例MDR-TB患者的單位成本越低，而熔解曲線技術成本也隨著該方法敏感度的增加而降低。進一步分析可見，以目前各項目地區的檢測成本為基礎，當熔解曲線技術檢出MDR-TB的敏感度高于70%，在結核病人群MDR-TB的患病率≤50%的情況下，使用熔解曲線技術進行耐多藥MTB檢測的單位成本均低于MGIT 960方法。

討 論

結核病的檢測方法包括病原學、免疫學和分子生物學檢測，其中痰涂片方法操作簡便、成本較低，但同時其陽性率較低。MTB培養并菌種鑒定仍是目前診斷結核病的金標準，改良羅氏培養和藥敏試驗一般需要4～8周才能出檢測結果，檢測周期較長，給臨床診療帶來不便；MGIT 960技術進行培養、藥敏試驗的時間平均約為2周，相比于改良羅氏培養和藥敏試驗大大縮短了檢測時間，并且其陽性標本檢出率也較改良羅氏培養和藥敏試驗提高10%左右[8-10]。因此，本次研究采用MGIT 960作為參考標準，進行成本的比較分析。隨著分子生物學技術的快速發展，MTB分子藥敏檢測技術近年來發展迅速，其中一些已經發展到根據檢測特定的基因突變位點來確定MTB的耐藥性[11-12]。基于耐藥探針分析的熔解曲線技術是一種具有自主知識產權、敏感度和特異度類似或接近于傳統藥敏檢測技術的耐藥MTB檢測方法，可用于檢測MDR-TB和對部分二線抗結核藥品的耐藥性。熔解曲線技術用于檢測MTB耐藥性的性能已獲得了良好的驗證。檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為92%～98%和96%～100%，檢測異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為90%～96%和96%～100%[13-16]。

表4 以MGIT 960檢測結果作為參考標準計算熔解曲線技術在不同MDR-TB患病率下檢出1例MDR-TB患者的平均成本(元)

注此表價格為測算數據；平均成本=平均單位成本/患病率×敏感度

實驗室成本分析是從衛生服務的角度出發，分析與該實驗室檢測相關的直接和間接的貨幣成本。本研究基于客觀數據分析，采用“要素法”比較了我國6家結核病防治機構實驗室將MGIT 960和探針熔解曲線技術用于結核病及MDR-TB診斷的成本。本研究發現，與MGIT 960的平均單位成本比較，使用熔解曲線技術進行MTB檢測的平均單位成本較低，較MGIT 960的成本低261.9元。在成本分析過程中不但要考慮試劑、設備及耗材等方面的投入，而且需要將房屋、人力及日常管理等費用按照試驗過程中對相關資源的使用狀況及時間等分攤到單位檢測成本中，由于熔解曲線技術大大縮短了檢測的時間，因此使管理、房屋使用、人員、設備耗材等各要素的成本低于MGIT 960。

在本項目評估的條件下，發現熔解曲線技術檢測每例患者及MDR-TB患者方面的成本都低于MGIT 960。主要原因考慮為：首先，熔解曲線技術的診斷周期約為2 d，而MGIT 960的周期約為2周，這將導致與時間相關的成本包括管理費、人員費、儀器費等成本上升；其次，熔解曲線技術的試劑成本低于MGIT 960，而試劑費在兩者的總成本中均占據較高比例，這導致MGIT 960擁有更高的成本費。不同地區的成本間也呈現出地域差異，其中個別項目點人員工資水平較高，這使得在各分項實驗中人員成本明顯高于其他地區。此外，各項目點實際情況不同，管理費用差異也較大，實驗所用耗材為各個地區項目辦采購，因此在耗材方面各個地區實驗室之間也表現出一定的差異。

除了較低的成本之外，與傳統MGIT 960相比，熔解曲線技術還具有其他優勢。首先，熔解曲線技術擁有更短的檢測時間，其完成整個檢測只需要2.5 h，比傳統MGIT 960的2周明顯縮短。其次，熔解曲線技術是一種基于核酸檢測的方法，具有更好的生物安全性。據一項研究顯示，使用傳統藥敏的實驗室人員，感染結核病的風險比使用涂片檢查的人員高20倍以上[17]。

本研究也存在很多不足之處，由于客觀條件受限，本研究雖然進行了實驗技術的成本收集，分析了2種檢測技術的相關成本，但是沒有考慮到收集檢測后改進治療方法費用或節省的成本，以及檢測后所延長的生命年或質量調整生命年等后期效益。因此，本研究的成本-效益分析仍然不夠全面。

綜合考慮上述因素及成本分析結果，本研究表明，在本研究的采購價格和當前市場價下，熔解曲線技術是一種更具成本-效益的方法，適宜未來在我國市(區、縣)級結核病實驗室推廣使用。