孕晚期婦女B族鏈球菌攜帶情況及耐藥機制研究

陳爍 齊孟 張穎 李向陽

B 族鏈球菌（group B streptococcus，GBS）亦稱無乳鏈球菌，是革蘭陽性球菌，常寄生于人體的直腸和泌尿生殖道，是孕晚期婦女和新生兒感染的重要病原菌[1]。圍生期孕婦感染GBS可導致菌血癥、無癥狀菌尿癥、早產、胎膜早破、羊膜炎和傷口感染等。新生兒感染GBS可導致膿毒癥、肺炎、腦膜炎和敗血癥，少數出現蜂窩織炎[2-3]。美國疾病與控制中心預防新生兒GBS感染的指南推薦應對所有35～37周孕婦進行GBS篩查[4]。我國孕前和孕期保健指南提出需要對具有高危因素的圍生期孕婦做GBS篩查[5]。篩查GBS陽性的孕婦至少在分娩前4h進行抗菌藥物預防，可有效避免新生兒感染GBS[6]。由于孕婦用藥特殊，預防的抗菌藥物首選青霉素，若青霉素過敏，藥敏試驗后選用頭孢唑林、紅霉素、克林霉素等[7]。本文對孕晚期婦女GBS攜帶情況及大環內酯類和林可酰胺類等藥物耐藥率及耐藥機制進行研究，為預防和控制孕晚期婦女及新生兒GBS感染提供依據，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 樣本收集 收集2018年7至11月溫州醫科大學附屬第二醫院、育英兒童醫院產科848份孕晚期（35～37周）婦女的陰道或直腸（肛門括約肌）拭子樣本。本研究經醫院倫理委員會審查通過，所有患者知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 紅霉素紙片（15μg）、克林霉素紙片（2μg）、左氧氟沙星紙片（5μg）、萬古霉素紙片（30μg）、Mueller-Hinton（MH）瓊脂培養基、腦心浸液肉湯培養基（英國Oxoid公司）、哥倫比亞血瓊脂培養基（20180618，鄭州人福博賽生物技術有限責任公司）、GBS顯色培養基（20180623，溫州市倍可特醫療器械有限公司）、細菌基因組DNA提取試劑盒（1907G04，上海捷瑞生物工程有限公司）、聚合酶鏈反應（PCR）擴增試劑盒（AI71101A，大連Takara公司）。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS，德國Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養與鑒定 使用無菌拭子采取孕晚期婦女陰道/直腸樣本，分別接種至哥倫比亞血瓊脂培養基及GBS 顯色培養基，5%CO2、（35±2）℃恒溫培養，于 24、48h判讀結果。可疑菌株進行CAMP試驗及MALDI-TOF MS鑒定確認。

1.3.2 藥敏試驗 按照美國臨床與實驗室標準化研究所（CLSI）2018年版指南進行紙片擴散法藥敏試驗。待測的GBS菌株經哥倫比亞血瓊脂培養基培養20～24h，使用無菌0.9%氯化鈉溶液將GBS配置成0.5麥氏濁度的菌懸液，均勻涂布于血MH培養基。紙片擴散法檢測紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星及萬古霉素耐藥性，紅霉素紙片和克林霉素紙片相距12mm，進行D環試驗檢測。5%CO2、（35±2）℃恒溫培養，20～24h 判讀結果。當克林霉素抑菌圈臨近紅霉素紙片一側出現截平現象（D環試驗），則為誘導型克林霉素耐藥。若抑菌圈內克林霉素紙片周圍出現模糊生長，也為克林霉素耐藥。

1.3.3 耐藥基因檢測 取GBS單菌落于3ml腦心浸液肉湯培養基，35℃、120rpm搖菌培養，按照試劑盒說明書，提取GBS菌株全基因組。PCR檢測GBS菌株的耐藥基因 ermA、ermB、ermC、ermTR、mefA/E 和 lnuB 基因，引物序列和片段長度，見表1[8-9]。PCR體系總體積20μl，滅菌雙蒸水 7μl，Tap mix 10μl，上游下游引物各 1μl，模板 DNA1μl。擴增條件：95°C 預變性 5min，95°C 變性30s，43～49°C 退火 30s，72°C 延伸 1min，共 35 個循環，72°C 10min。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗證，出現相應條帶即為陽性。PCR產物送上海桑尼生物科技有限公司進行測序，將ermB、ermTR、mefA/E和lnuB基因測序結果與NCBI中已有的耐藥基因序列（NG_047798.1、AF_002716.1、NG_047963.1、NG_047921.1 等）進行BLAST比對。

2 結果

2.1 GBS檢出情況 848份樣本中共檢出95株GBS，陽性率為11.2%。其中哥倫比亞血瓊脂培養基檢出57株，GBS顯色培養基檢出92株（3株不溶血GBS未檢出）。

表1 PCR擴增耐藥基因引物序列和片段長度

2.2 藥敏試驗結果 95株GBS中紅霉素耐藥75株，中介1株，敏感19株；克林霉素耐藥78株，敏感17株；左氧氟沙星耐藥29株，敏感66株；萬古霉素全部敏感。具體藥敏結果見表2。3種抗菌藥物同時耐藥占28.4%（27/95）；左氧氟沙星耐藥株中，93.1%（27/29）為紅霉素和克林霉素耐藥株。

表2 95株GBS藥敏試驗結果[株（%）]

2.3 耐藥表型檢測結果 經D環試驗檢測，95株GBS中69株為紅霉素克林霉素結構耐藥表型（cMLSB），占72.6%、5株為紅霉素誘導克林霉素耐藥表型（iMLSB，D環試驗陽性）、1株為紅霉素耐藥、克林霉素敏感表型（M）、3株為紅霉素敏感、克林霉素耐藥表型（L）。

2.4 耐藥基因檢測結果 PCR檢測到59株攜帶ermB基因、29株攜帶mefA/E基因，19株攜帶lnuB基因，2株攜帶ermTR基因，未檢測到ermA、ermC基因。1株cMLSB和2株L型未檢測到耐藥基因。1株紅霉素中介、克林霉素敏感株檢到mefA/E基因，1株紅霉素克林霉素雙敏感株檢到mefA/E和lnuB基因。具體耐藥表型與基因型關系見表3，基因電泳圖見圖1。

3 討論

本次篩查顯示孕晚期婦女GBS陽性率為11.2%，提示攜帶率高，需要對所有孕晚期婦女進行GBS篩查。此次篩查采用的GBS顯色培養基檢出率較血瓊脂培養基高，但無法檢測極少數不溶血GBS，綜合判斷有助于更準確篩查。

本研究中篩查出的GBS對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星的耐藥率分別為78.9%、82.1%、30.5%，萬古霉素全敏感，3種藥物同時耐藥的占28.4%，紅霉素和克林霉素耐藥率相較本院2015年耐藥率（71.0%，69.9%）升高，紅霉素和克林霉素耐藥率較歐洲、北美、南非等地耐藥率高[10-11]。耐藥率上升可能與近年來紅霉素與克林霉素在女性泌尿生殖道治療中的廣泛應用，尤其是支原體的治療相關[12]。左氧氟沙星耐藥株中，93.1%為紅霉素和克林霉素耐藥株，提示左氧氟沙星耐藥株，其紅霉素和克林霉素極可能耐藥，可以進一步探討之間的關系。2018年版CLSI提示，對青霉素過敏孕婦的GBS分離株需要做藥敏試驗，并進行誘導型克林霉素耐藥試驗，若D環試驗陽性，則應報告克林霉素耐藥。目前發現GBS對青霉素的敏感性有所下降，由于孕婦用藥特殊性，對孕晚期婦女GBS的耐藥監測，需要引起足夠重視[13-14]。

目前報道的GBS對大環內酯類耐藥主要由erm基因和mef基因介導。erm基因編碼23S rRNA甲基化酶，改變抗菌藥物靶位點的結合，阻止大環內酯類和林可酰胺類抗菌藥物與核糖體亞基結合。mefA/E基因編碼外排泵介導大環內酯類耐藥。lnuB基因編碼核苷酸轉移酶導致克林霉素耐藥[10]。GBS經D環試驗檢測，主要耐藥表型為cMLSB，占90.9%，這與北京、東莞等研究相似，證明我國大部分地區以cMLSB耐藥表型為主[9，15]。

此次研究中，ermB基因攜帶率最高，為62.1%；mefA/E、lnuB和ermTR基因攜帶率分別為30.5%、20.0%和2.1%。ermB、mefA/E基因攜帶率與我國其他地區報道相似，與歐美、巴西等地相差較大，lnuB攜帶率明顯高于北京、廣東等地區[15-16]。有研究者認為，lnuB基因在GBS中可能不傳播或以極低頻率傳播，lnuB基因可能起源于源于腸球菌的質粒，可移動到質粒或染色體中[17]。基因型以僅攜帶ermB為主，占50.5%，其次為mefA/E，ermB+lnuB和ermB+mefA/E基因型。1株cMLSB和2株L型未檢測到耐藥基因，可能是含有其他耐藥機制。1株紅霉素、克林霉素全敏感型檢測到mefA/E+lnuB基因。有研究顯示，ermB基因單個核苷酸SNP突變會導致23S rRNA甲基化酶功能改變，影響大環內酯類抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）[18]。

綜上所述，溫州地區孕晚期婦女GBS攜帶率高，紅霉素和克林霉素耐藥率較高，且以cMLSB結構耐藥表型為主，左氧氟沙星耐藥株其紅霉素和克林霉素也多耐藥；ermB耐藥基因為大環內酯類、林可酰胺類耐藥主要機制，lnuB基因攜帶率高于其他地區。

表3 GBS耐藥表型與基因型關系（株）

圖1 耐藥基因PCR電泳圖（Marker：DL1000Marker，1～4泳道分別為mefA/E、ermB、ermTR、lnuB 基因，5泳道為陰性對照）