培養條件及添加劑對重組熒光藻藍蛋白β亞基胞外分泌的影響

趙保國，蔣蘇丹，汪長天，伍賢軍,2*，李萍萍,2*

1(南京林業大學 生物與環境學院，江蘇 南京，210037)2(南京林業大學,江蘇省南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京，210037)

藻藍蛋白是存在于藻類中的捕光色素蛋白。從螺旋藻中獲取的C-藻藍蛋白(C-phycocyanin，C-PC)在醫療保健、食品添加劑、化妝品著色劑和熒光染料等方面有廣泛的應用前景[1]，特別是其抗氧化、抗癌、抗炎和增強免疫力的功能引起廣泛的關注[2-4]。C-藻藍蛋白由α和β亞基組成，開鏈的四吡咯藻藍色素(phycocyanobilin，PCB)共價結合在蛋白質保守性半胱氨酸結合位點上。由于從分子水平上對PCB生物合成過程的解析以及對藻藍蛋白裂合酶的鑒定，C-藻藍蛋白α和β亞基均可在大腸桿菌體內重組產生。其中，β亞基脫輔基蛋白可在藻膽蛋白裂合酶(phycobiliprotein lyase，CpcS)的催化下結合PCB[5]。而PCB來源于對大腸桿菌血紅素底物的氧化還原反應，即在血紅素氧化酶(heme oxidase-1，HO1)的作用下將血紅素轉化成膽綠素(biliverdin，BV)，在膽綠素還原酶(ferredoxin oxidoreductase，PcyA)的作用下最終合成PCB。研究表明，大腸桿菌重組藻藍蛋白β亞基(β-subunit of C-phycocyanin，CpcB)展現出顯著的抗氧化和自由基清除活性[6-8]。為獲取在大腸桿菌體內重組的外源蛋白，通常需要破碎細胞，這經常會導致熱原水平和樣品雜質的增加以及蛋白質活性的降低。特別地，當目的蛋白在胞內過量表達時，會形成包涵體。在重組藻藍蛋白的過程中，通常用降低表達溫度的方法減少包涵體的形成，使得色素蛋白能有效合成和正確折疊[9]。但是對于大量生產和工業發酵，這會降低產量和增加生產成本。為了克服這些缺陷，采用胞外分泌重組藻藍蛋白是有效的方法。為促進重組蛋白的胞外分泌，各種策略被廣泛研究，如信號肽優化[10]、細胞質滲漏[11]、分子伴侶共表達[12]等。除此之外，還可以對培養條件進行優化，如調整溫度，改變誘導劑以及使用影響細胞膜通透性的化學物，如甘氨酸、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)和Tween-80等[13-15]。通過這些方法可以顯著強化重組蛋白的分泌。目前，藻藍蛋白胞外分泌的特征及影響因素并不清楚，特別是藻藍蛋白的色素化增加了胞外分泌的復雜性。本研究通過改變溫度，利用乳糖作為誘導劑，利用培養基添加劑等方式促進螺旋藻重組熒光藻藍蛋白CpcB的胞外分泌，并以藻藍蛋白熒光強度為表征[16]，探討影響藻藍蛋白胞外分泌的因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含有表達質粒pETDuet-cpcB-cpcS∶∶ho1 ∶∶pcyA的重組E.coliBL21(DE3)菌株pBSA，由本實驗室構建并保存[6]，其中表達載體pETDuet-1，購于Novagen公司，藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白編碼基因cpcB來自鹽澤螺旋藻SpirulinasubsalsaFACHB351，藻藍蛋白裂合酶編碼基因cpcS、血紅素氧化酶編碼基因ho1、膽綠素還原酶編碼基因pcyA，均來自于Nostocsp. PCC 7120。

蛋白胨、酵母粉，OXOID公司；甘油、氨芐西林，盛興生物科技有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)，北京博奧拓達科技公司產品；乳糖，上海凜恩科技發展有限公司；甘氨酸和Triton X-100，廣州賽國生物科技有限責任公司；SDS，上海凌峰化學試劑有限公司；Tween-80，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Lambda 365紫外/可見分光光度計和LS 55熒光光譜儀, 美國Perkin Elmer公司；ZWY-240恒溫搖床, 上海智誠分析儀器制造有限公司；MIKRO 200R高速離心機, 德國Hettich公司；BG-verMIDI蛋白質電泳儀，北京百晶生物技術有限公司；Sigma 3-18KS冷凍離心機，德國Sigma離心機有限公司；GenoSens1850凝膠成像儀, 上海勤翔科學儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養及重組蛋白表達

少量接種實驗室保存的重組菌株pBSA到5 mL含100 mg/L氨芐抗生素的LB培養基中，置于恒溫搖床中，37 ℃、150 r/min過夜培養。轉接0.5 mL過夜培養的新鮮菌液到50 mL TB培養基中，在37 ℃、220 r/min的條件下繼續培養，直到OD600值為0.6，4 ℃保存。

為研究表達溫度對重組熒光藻藍蛋白胞外分泌的影響，按照上述方法培養3組50 mL菌液，添加或不添加1 mmol/L的IPTG的情況下，分別置于溫度為16、25、37 ℃的恒溫搖床中200 r/min培養，每隔12 h取3 mL菌液，12 000 r/min離心10 min棄沉淀，取培養基上清液，檢測CpcB的熒光強度。實驗獨立重復3次，最終培養基中CpcB的熒光強度取3次平均值。

為研究誘導劑乳糖對CpcB胞外分泌的影響，分別轉接0.5 mL過夜培養的新鮮菌液到6組50 mL TB培養基中，37 ℃、220 r/min培養，直到OD600值為0.6，冰浴30 min。各組分別加入終質量濃度為5、7.5、10、15、20 g/L的乳糖，并以未加乳糖的作為對照。置于搖床，200 r/min，25 ℃誘導表達24 h，取3 mL菌液12 000 r/min離心20 min棄沉淀，取培養基上清液檢測CpcB的熒光強度和OD600值。實驗獨立重復3次，最終數據取3次平均值。

為探索培養基添加劑(甘氨酸，Triton X-100，SDS，Tween-80)對CpcB胞外分泌的影響，按照上述方法培養若干50 mL的重組大腸桿菌菌液冰浴。菌液分成4大組，每1大組分成6小組，加1種添加劑。其中甘氨酸的終質量濃度為15、20、25、30、35 g/L，Triton X-100的終體積分數為0.1%、0.2%、0.5%、0.7%和1%，SDS的終質量濃度為0.5、1、2、5、10 g/L，Tween-80的終體積分數為1%、1.5%、2%、2.5%和5%，并以未加添加劑的菌液為對照，置于搖床中200 r/min培養24 h，取3 mL菌液12 000 r/min離心20 min棄沉淀，取培養基上清檢測CpcB熒光強度。實驗獨立重復3次，最終數據取3次平均值。

1.3.2 重組蛋白純化、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及鋅電泳

為確認重組蛋白CpcB的光譜特征和分子質量，用100 mL的TB培養基在200 r/min，25 ℃條件下表達重組菌株24 h，全部菌液12 000 r/min離心20 min棄沉淀，取上清對培養基中的CpcB進行純化，并取少量的培養基制備電泳樣品，準備SDS-PAGE電泳。由于表達載體pETDuet含有His標簽，故可以利用鎳離子親和層析柱進行蛋白質的純化，并透析去除咪唑[8]。純化后的CpcB溶液可用于光譜分析；同時取少量CpcB溶液制備電泳樣品。制備好的蛋白質樣品用12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后將蛋白質膠用 1.5 mol/L 醋酸鋅溶液浸泡15 min染色，置于凝膠成像儀中用紫外光照射成像，凝膠再用考馬斯亮藍染色后成像。

1.3.3 熒光檢測和光譜分析

利用熒光光譜儀(Perkin Elmer LS 55，美國)檢測胞外培養基CpcB的熒光強度，所用激發波長為600 nm，收集的熒光發射波長為640 nm。由于重組熒光藻藍蛋白的熒光強度和表達量在一定范圍內存在線性關系[16]。故可以通過熒光強度反映藻藍蛋白的產量，即可以通過培養基熒光CpcB的熒光強度大致反映胞外分泌的CpcB濃度。利用熒光光譜儀檢測胞外培養基CpcB的熒光發射光譜，激發波長為600 nm。光譜掃描范圍300～800 nm，光譜掃描速度1 200 nm/min，狹縫寬度10.0 nm。吸收光譜用紫外可見分光光度計檢測，光譜掃描范圍200～800 nm，掃描速度960 nm/min，狹縫寬度1.0 nm。

2 結果與分析

2.1 溫度對CpcB胞外分泌的影響

在大腸桿菌胞內合成藻藍蛋白的過程中，最佳溫度常設定在18 ℃左右[9]。本研究中，首先參照胞內合成的條件，在16 ℃的條件下加入1 mmol/L的IPTG表達CpcB直到60 h，如圖1-a所示，胞外培養基中沒有檢測到任何CpcB熒光；在沒有IPTG的條件下，如圖1-b所示，也沒有檢測到熒光。低溫下胞內合成的藻藍蛋白不向胞外分泌，這可能與低溫抑制細胞的生長率和轉運蛋白的表達有關[17]。而在37 ℃，無論是添加IPTG還是沒有添加IPTG，都不能檢測到培養基中CpcB的熒光。較高溫度下過表達的蛋白質容易形成包涵體并在內膜附近積累，阻斷蛋白質的易位通道，減少分泌[18]。另外，藻藍蛋白的色素化也可能受阻。在25 ℃沒有IPTG存在的情況下，如圖1-b所示，表達24 h后培養基展現明顯的CpcB熒光，并且隨著表達時間的增加，熒光強度逐步升高。這些結果表明溫度是影響胞外分泌的關鍵因素，而25 ℃是促進藻藍蛋白胞外分泌的較好溫度，這與先前研究的其他蛋白胞外分泌最佳溫度一致[13]，表達溫度應該保持細胞生長和蛋白合成的平衡以促使胞外分泌。

a-不同溫度有IPTG誘導對培養基CpcB熒光強度的影響； b-不同溫度無IPTG誘導對培養基CpcB熒光強度的影響
圖1 溫度對胞外培養基CpcB熒光強度的影響
Fig.1 Effect of temperature on the fluorescence intensity of the extracellular CpcB in medium

本研究中，誘導劑IPTG的存在使得胞外CpcB產生受阻，這可能與IPTG抑制細菌生長及自身蛋白的表達，影響重組CpcB的分泌通道有關。不過先前的研究利用IPTG誘導外源蛋白在信號肽的作用下是可以分泌的[14]，有可能歸因于先前研究中信號肽的強化作用，但需要進一步的證實。檢測胞外培養基熒光發射光譜，如圖2所示，在644 nm處展現最大熒光發射峰，這和先前CpcB的光譜特征一致[6]。

圖2 大腸桿菌25℃表達24 h后胞外培養基CpcB的 熒光發射光譜
Fig.2 Fluorescence emission spectrum of the extracellular CpcB expressed byE.colifor 24 h at 25℃

為進一步鑒定培養基中的CpcB，25 ℃表達100 mL重組細胞，24 h后對培養基進行純化，檢測純化后蛋白溶液的吸收光譜和熒光發射光譜。如圖3-a﹑圖3-b所示，純化后蛋白溶液展現出621 nm的最大吸收值和644 nm的最大熒光發射值，這與先前胞內合成的CpcB光譜特征完全一致[6]。取純化前后的胞外培養基進行SDS-PAGE電泳。如圖4所示，由于對培養基中CpcB的純化不佳，存在非特異性條帶，但純化前后培養基能看出在20 kDa左右有條帶。凝膠鋅離子染色后，純化前CpcB條帶有較弱的熒光，純化后CpcB條帶有較強的熒光。這些結果都表明分泌到胞外培養基中的CpcB的光譜特征和分子質量與胞內合成的一致[6]。

a-胞外培養基中CpcB純化后吸收光譜；b-胞外培養基中 CpcB純化后熒光發射光譜
圖3 純化胞外培養基CpcB的吸收光譜和熒光發射光譜
Fig.3 Absorption spectrum and fluorescence emission spectrum of the purified extracellular CpcB in medium

1、 4-蛋白質marker；2-培養基中CpcB純化前考馬斯亮藍染色； 3-培養基中CpcB純化后考馬斯亮藍染色；5-培養基中CpcB純化前 鋅離子染色；6-培養基中CpcB純化后鋅離子染色；箭頭指示CpcB位置
圖4 胞外培養基CpcB純化前后的SDS-PAGE和 鋅電泳分析
Fig.4 Analysis of the extracellular CpcB in medium before and after purification by gradient SDS-PAGE and chromoprotein Zn2+electrophoresis

2.2 乳糖作為誘導劑對CpcB胞外分泌的影響

基于T7為啟動子的表達系統除了可以用IPTG，還可以用乳糖誘導表達。為了驗證乳糖誘導重組藻藍蛋白的表達及胞外分泌情況，按照實驗方法1.3.1在25 ℃添加乳糖表達藻藍蛋白。結果如圖5-a所示，表達24 h后，與沒有添加乳糖相比，添加乳糖的重組體系培養基中CpcB的熒光強度顯著增加，當乳糖的質量濃度為10 g/L時，培養基CpcB的熒光強度達到最大值，是沒加乳糖時的5.1倍。10 g/L的乳糖是誘導CpcB胞外分泌的最佳濃度，這與先前的乳糖誘導胞外脫乙酰幾丁質酶最佳濃度一致[14]。如圖5-b所示，添加乳糖后細胞OD600值也有少量增加，乳糖促進細胞的生長。乳糖無毒廉價、不抑制細胞生長、不影響分泌通道的形成，甚至可以為細胞生長提供碳源，這有益于可溶性蛋白的表達。先前的研究也表明比起IPTG，乳糖是蛋白異源表達和胞外分泌更好的誘導劑[14, 19]。

a-乳糖對熒光強度的影響；b-乳糖對細胞生長的影響
圖5 乳糖誘導對胞外培養基CpcB熒光強度的影響
Fig.5 Effect of lactose on the fluorescence intensity of the extracellular CpcB in medium

2.3 培養基添加劑對CpcB胞外分泌的影響

通過補充培養基添加劑改變細胞膜通透性或增強周質空間的滲透壓是增加外源蛋白胞外分泌的重要途徑[13]。為了解培養基添加劑對藻藍蛋白胞外分泌的影響，按照實驗方法1.3.1分別向培養基中添加不同濃度的甘氨酸、Triton X-100、SDS和Tween-80等化學物。當添加甘氨酸時，結果如圖6-a所示，甘氨酸顯著增加胞外培養基CpcB的熒光強度。當甘氨酸的終質量濃度為25 g/L時，培養基熒光強度最高，是未加甘氨酸的5.1倍。甘氨酸作為增強重組蛋白胞外分泌的有效添加劑被廣泛研究，如ZOU等[19]通過加入10 g/L的甘氨酸將胞外支鏈淀粉酶的活性提高8.3倍；HUANG等[14]加入1%的甘氨酸使得胞外脫乙酰幾丁質酶活性增加2.4倍；VON ROMAN等[20]用20 g/L的甘氨酸和180 mmol/L的Tris使得SpA產量增加40倍。其機制是重組蛋白胞內合成后部分被遷移到周質空間，細胞質外膜為平衡壓力釋放少量的蛋白到培養基中，而甘氨酸插入肽聚糖、破壞細胞外膜的完整性，強化重組蛋白從周質空間到培養基的分泌[21-22]。表面活性劑Triton X-100和SDS也被認為是改善重組蛋白胞外分泌的有效添加劑[15, 23]。但在本研究中，添加Triton X-100和SDS到培養基中，結果如圖6-b、圖6-c所示，培養基CpcB的熒光強度并沒有明顯增強。Triton X-100對外膜的影響機制是破壞脂質雙層膜[22,24]；而SDS抑制脂肪酸的合成，導致膜磷脂合成不足[23]。故Triton X-100和SDS對細胞膜的破壞比甘氨酸要強很多，這可能是造成它們不如甘氨酸有效的重要原因。另外，熒光藻藍蛋白的合成需要PCB和脫輔基蛋白CpcB的結合，推測Triton X-100和SDS有可能干擾CpcB和PCB的連接，但這需要進一步的證實。少量的Tween也能增強膜的通透性。劉軍等[25]報道添加適量的Tween-80可提高胞外蛋白酶的酶活。本研究添加體積分數為1.5%的Tween-80到培養基中，如圖6-d所示，培養基CpcB熒光強度增加2.5倍。重組藻藍蛋白胞外分泌不僅受到單個因素的影響，各因素之間也相互影響，特別是不同添加劑之間的協同效應[15]。進一步的研究可對表達溫度、乳糖、甘氨酸及Tween-80等因素進行協同考慮，獲得最優的表達條件，高效地提升藻藍蛋白的胞外分泌。

圖6 培養基添加劑對胞外CpcB熒光強度的影響
Fig.6 Effect of medium additives on the fluorescence intensity of the extracellular CpcB

3 結論

藻藍蛋白是被廣泛報道的生物活性物質。為促使大腸桿菌重組藻藍蛋白β亞基CpcB分泌到胞外培養基中，對溫度、誘導劑和培養基添加劑等因素研究后發現,25 ℃未加誘導劑的條件下，CpcB表達24 h胞外培養基展現CpcB的熒光，藻藍蛋白能分泌到培養基；加入IPTG誘導或者在16 ℃或37 ℃的條件下，胞外培養基沒有明顯的熒光；添加10 g/L的乳糖誘導表達，胞外培養基CpcB的熒光強度提高5.1倍；添加25 g/L的甘氨酸改變細胞膜的通透性可使胞外培養基CpcB的熒光強度提高6.3倍，添加體積分數為1.5%的Tween-80胞外CpcB熒光強度也增加2.5倍，而Triton X-100和SDS并沒有改善熒光CpcB的胞外分泌。該研究為促進重組藻藍蛋白胞外分泌，提高藻藍蛋白異源生產的效率提供參考。