藻菌共生小球的制備及其脫氮效能

■李科靜 周詩琪 聶凌云 葛燕婷 余建波 李德亮

（湖南農業大學動物科學技術學院，長沙 410128）

水產養殖業是我國農業的重要組成部分，在提供優質動物蛋白和改善居民膳食結構方面做出了突出的貢獻。2019年，全年水產品產量6,450萬t，其中養殖水產品產量5,050萬t，養殖產量連續30年穩居世界第一（2019年國民經濟和社會發展統計公報）。近年來，隨著產業集約化和規模化程度的不斷增強，水產養殖業對水域環境的潛在威脅日益受到政府和社會的高度關注。氨氮和亞硝酸鹽氮不僅是養殖尾水排放監管的兩大重要指標，而且高濃度的氨氮和亞硝酸鹽能損害養殖對象的組織結構、生理特征和代謝能力，從而導致大量死亡。隨著國家水產養殖尾水污染物排放相關規范標準的相繼出臺，養殖水體的綜合治理與修復將成為水產養殖業日常管理的重要內容之一，研發養殖水體營養鹽原位修復技術和養殖尾水異位凈化技術也必將成為水產養殖業所面臨的重要產業和技術問題。

藻—菌共生體系顧名思義為藻類和菌類之間通過協調作用達到凈化水體目的的一種共生技術體系。水中的有機污染物經好氧型細菌氧化分解產生CO2和NH4+、PO4

3-等無機成分，能被藻類所吸收，且經葉綠素的光合作用合成自身細胞物質，并釋放O2供細菌繼續氧化有機物之用。目前，藻菌共生技術中常用的微藻主要有螺旋藻、小球藻、銅綠微囊藻、衣藻、月牙藻、柵藻、短帶鞘藻、念珠藻、褐胞藻等，而常用的菌類有硝化細菌、芽孢桿菌、曲霉菌、黃曲霉、黑曲霉、煙曲霉等。盡管如此，小球藻和米曲霉共生體系在養殖水體脫氮除磷方面的應用還相對較少。為此，本研究通過制備小球藻與米曲霉的共生體系，分析該共生體系對水中氨氮、亞硝酸鹽氮的去除能力，以期為池塘養殖水體的凈化和修復處理提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 小球藻和米曲霉培養

實驗用普通小球藻（Chlorellavulgaris）和米曲霉（Aspergillusoryzae）均由中南大學環境與水資源研究中心提供。BG11為培養基，小球藻于26℃、光照強度4,000lx、12L∶12D條件下批量培養，待其生長至對數期，4,000rpm離心5min，去上清，收集藻細胞。米曲霉的培養方法，即將米曲霉孢子接種于pH值7.0的改良馬丁固體培養基后，置于28℃的恒溫箱中培養3～5d，待其長出黃綠色孢子后，將菌種置于改良馬丁固體培養基中并4℃保存，備用。

圖1 不同小球藻密度條件下形成的藻菌共生小球

1.2 共生小球的構建

將米曲霉孢子接種于盛有無菌改良馬丁液體培養基的250mL錐形瓶中，輕搖1min，封口，置于28℃的恒溫振蕩器中，160r/min震蕩培養48h，形成穩定的白色真菌小球。將 350個左右真菌小球用滅菌的生理鹽水沖洗2～3次后分別置于細胞密度為3×106、6×106、9×106、12×106、15×106、18×106、21×106cell/mL的錐形瓶中，置于26 ℃的恒溫振蕩器中、光照強度1,800lx、160r/min，12L∶12D條件下培養與小球藻共同培養，制備藻菌共生小球。每個處理組重復3次。培養24h后，輕輕混勻培養液，取少量培養液、0.45μm 針式過濾器過濾，分光光度計測定濾液吸光度，以確定培養液中藻細胞密度，從而評價米曲霉小球對小球藻的固定率。

1.3 共生小球的脫氮效能

取350個真菌小球放入250mL錐形瓶中與小球藻共同培養，小球藻密度為8.75×106（固定率最優組）的培養液中培養，形成穩定的藻-菌共生小球體系備用。在該共生體系中添加氯化銨和亞硝酸鈉使氨氮（NH3-N）和亞硝酸鹽氮（NO2--N）終濃度分別達到2.0mg/L和1.0mg/L。重復4次。分別于共同培養后1、3、6、9、12、24、48h后取少量培養液，用0.45μm針式過濾器過濾后，采用德國CleverChem全自動化學分析儀測定其NH3-N和NO2-N含量。

1.4 數據分析

圖2 米曲霉小球對不同密度小球藻的固定率

圖3 藻菌共生小球對NH3-N和NO2-N的去除情況

米曲霉小球對小球藻的固定率=（初始藻細胞密度-取樣時藻細胞密度）/初始藻細胞密度。分別采用Excel2016和SPSS22.0軟件進行數據統計與分析，Origin9.0軟件制圖。

2 結果

2.1 藻菌共生小球的制備與優化

圖1顯示，分別將350個米曲霉真菌小球放入藻細胞密度為3×106、6×106、9×106、12×106、15×106、18×106、21×106cell/mL的錐形瓶中，與小球藻混合震蕩培養24h后，培養液中藻細胞會逐步附著在真菌小球表面，真菌小球由白色變成淺綠色。錐形瓶中的培養液顏色會隨著藻細胞被米曲霉小球固定由深綠色逐漸變淺，直至清澈透明，但不同藻細胞密度與真菌小球的結合情況不同，形成顏色深淺不同的共生小球。藻細胞密度為15×106、18×106、21×106cell/mL時真菌小球對藻細胞的固定效果相對較差，表現為培養液顏色呈現藻細胞的綠色。

以共生體系培養基中藻細胞初始密度為橫坐標，米曲霉小球對小球藻的固定率為縱坐標，擬合的細胞密度與固定率曲線呈現先上升后下降的整體趨勢 （圖2）。該曲線的回歸方程為y=-4×10-13x2+7×10-6x+66.558（R2=0.908）。經計算得知，藻細胞密度為8.75×106cell/mL時，米曲霉菌小球對小球藻的固定率最高。

2.2 藻菌共生小球的脫氮效能

實驗期間，對照組NH3-N含量總體保持穩定，在初始值1.126mg/L基礎上輕微波動。藻菌共生小球組培養液中NH3-N含量隨實驗時間的延長呈現顯著的下降趨勢，在9h時去除率達到了最大值99.0%。實驗結束時氨氮平均濃度為0.085mg/L（圖3）。對照組NO2-N含量總體保持穩定，在初始值1.114mg/L基礎上輕微波動。實驗開始12h后，藻菌共生小球組培養液中NO2-N去除率達到最大值 99.8% （圖3）。

3 討論

藻菌共生體系是通過藻類和菌類之間協調作用而達到凈化水體的一種生物處理技術體系。水體中的有機污染物，經藻菌共生體系中好氧型細菌氧化分解產生CO2和 NH4+、PO43-等營養鹽，藻類吸收這些營養鹽并通過葉綠素的光合作用合成自身細胞物質，釋放 O2供細菌繼續氧化有機物之用。因此，藻菌共生技術因具有效果好、周期短、二次污染小、成本低和易回收等優點而展示廣闊的應用前景。本研究采用小球藻和米曲霉來制備藻菌共生體系，發現將小球藻細胞密度從3×106cell/mL 開始升高到21×106cell/mL，米曲霉小球對小球藻的固定率隨著藻細胞密度呈現先增后降的趨勢，經方程擬合計算，密度為8.75×106cell/mL 時米曲霉小球對小球藻細胞的固定效率最佳，這為下一步利用藻菌共生小球對水體進行脫氮處理研究與實踐奠定基礎。

養殖水體中含有大量的氮、磷營養鹽，高濃度的氨氮和亞硝酸鹽不但能損害養殖對象的組織結構、生理特征和代謝能力，導致養殖對象的大量死亡，也能對漁業環境造成影響。因此，氨氮和亞硝酸鹽氮也是養殖尾水排放重點監控指標。大量研究顯示，藻菌共生體系可以有效地去除養殖水體中的氮磷營養鹽。共生體系中地衣芽孢桿菌、硝化細菌、月芽藻、四尾柵藻比例為1∶2∶2∶2時，對養殖廢水 NH4+-N、NO2--N、NO3--N 和TP 的去除效果最佳，去除率分別達到89.16%、100%、98.62%和100%。小球藻和芽孢桿菌共生系統對海水養殖尾水的中NH4+-N、PO43+-P、TP和CODMn的去除率分別為 96.57%、98.62%、89.89% 和 39.09%。本研究制備的米曲霉和小球藻共生小球能夠有效的去除水中NH3-N和 NO2-N，且在12h內去除率幾乎接近100%（圖3），進一步證實通過合適的藻菌共生體系，可以有效地消除養殖水體氮營養鹽。本研究構建的小球藻和米曲霉共生小球具有起效速度快，去除效率高等優點，在水體凈化處理方面具有較大的應用潛力。盡管如此，該藻菌共生系統在養殖尾水處理的產業化應用方面，仍面臨諸多問題，如共生小球在養殖水體中的去除效率、共生小球固定載體的選擇、載體的固定效率和共生小球的回收等均有待于進一步地深入研究與試驗，而這些也是未來藻菌共生技術的研究方向。（參考文獻略）