應激寧亞慢性毒性試驗

1 材料與方法

1.1 受試藥物

應激寧，批號：20190725，由武漢華揚動物藥業有限責任公司提供。

1.2 實驗動物

6周齡清潔級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體重公鼠在130～150g之間，母鼠在120～140g之間，由揚州大學比較醫學中心提供。動物生產許可證號：SCXK（蘇）2012-0004，使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0029。

1.3 實驗分組

將80只Wistar大鼠隨機分為4組，分別為應激寧高、中、低劑量組和空白對照組，每組20只，雌雄各半。組內動物個體體重相差應不超過平均體重的20%，組間平均體重相差不超過5%。

1.4 給藥劑量及給藥途徑

由于急毒試驗沒有測出LD50，90d喂養試驗的高劑量組按最大耐受劑量10g/Kg（根據90d喂養試驗指導原則確定為靶動物攝入量的100倍，靶動物推薦的攝入量為100mg/kg，試驗大鼠即100mg/Kg×100=10g/Kg），混飼給藥，分為低，中，高劑量組及對照組。給藥各組劑量分別定為：0.0g/KgBW，2.5g/KgBW，5.0g/KgBW，10g/KgBW，連續給藥90d。

期間受試藥物給予量按大鼠每日飼料攝入量折算為飼料中受試藥物濃度。因此在喂養試驗的前30d大鼠每日飼料攝入按體重的10%折算，即將應激寧分別按2.5%、5.0%和10.0%的濃度添加于由比較醫學中心提供的大鼠全價飼料的原粉料中，經充分混勻后熱擠壓制成顆粒料喂養。在喂養試驗的后60d大鼠每日飼料攝入按體重的8%折算，即將應激寧分別按3.125%、6.25%和12.5%的濃度添加于大鼠全價飼料的原粉料中，經充分混勻后熱擠壓制成顆粒料供喂養。（注計算說明：高劑量組，大鼠1Kg的每日飼料攝入量為1,000g×10%＝100g，大鼠1Kg應給予的應激寧劑量為10g，即1Kg大鼠每日攝入的100g飼料中應添加應激寧10g。因此，折算成濃度百分比為10%，其他劑量類推。）

1.5 試驗期間臨床觀察

服藥期間每天肉眼觀察大鼠的一般行為（包括精神狀態，行為活動，采食量，飲水量，毛色，對外反應，糞便等）、中毒及死亡情況；同時記錄飲水量、采食量，并按周測量大鼠體重，投入飼料量和剩余飼料量。并計算平均攝食量、增重。將染毒劑量組與對照組加以比較和統計學處理，及時記錄和分析大鼠的中毒癥狀及出現各癥狀的先后次序、時間。

1.6 血液學和血液生化檢測

在給藥45d和90d結束時，各組隨機抽取10只大鼠（雌、雄各半）采血進行血液學指標檢測（包括血紅蛋白、紅細胞計數、白細胞計數和分類等）和血液生化指標檢測（包括谷草轉氨酶（AST或SGOT）、谷丙轉氨酶（ALT或SGPT）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（GLu）、血清白蛋白（Alb）、總蛋白（TP）、總膽固醇（TCH）和甘油三脂（TG）等）。

表1 對大鼠體重的影響（n=10）

1.7 病理檢查

1.7.1 大體剖檢

于給藥45d和90d試驗結束，各組分別取10只大鼠（雌、雄各半）進行剖檢（可結合采血進行）。做好記錄，并將重要器官和組織固定保存。

1.7.2 臟器稱重

剖檢試驗大鼠的同時，稱取大鼠體重及各主要臟器（包括肝、肺、心、腎、脾、胃腸、睪丸/子宮等）重量，計算各臟器系數。

1.7.3 組織病理學檢查

對高劑量組及對照組大鼠的主要臟器進行組織病理學檢查，發現病變后再對較低劑量組大鼠的相應器官及組織進行檢查。

1.8 數據處理

2 結果

2.1 臨床表現

各組大鼠拌飼給藥直至90d，均無死亡，期間精神、活動，采食行為、飲水行為、毛色、對外反應和糞便等臨床表現正常，沒有出現病理狀態和死亡。

2.2 對大鼠體重的影響

試驗期間，每周對各組大鼠稱重1次，統計周平均體重和周增重率。結果第1周高劑量組母鼠的周均增重率顯著低于空白對照組（P＜0.05），其余各周各給藥組母鼠的均重和周均增重率與空白對照組均無顯著差異；第1～7周各給藥組公鼠的均重都顯著低于空白對照組（P＜0.05），第8～12周部分給藥組公鼠的均重仍顯著低于空白對照組（P＜0.05），但各給藥組公鼠的周均增重率只有第1、2周顯著低于空白對照組（P＜0.05），而第3周后各給藥組公鼠的周均增重率與空白對照組均無顯著差異，甚至有許多周還高于空白對照組的周均增重率，詳細結果見表1。引起這現象的原因是由于給各藥組所給藥物應激寧分別達到了飼料含量的2.5%、5.0%和10.0%（指導原則要求高劑量組應為靶動物攝入量的100倍），從而一定程度上降低了飼料的能量、蛋白質和其他營養物質的含量和影響了適口性，因而造成飼料攝入量應該較多的公鼠在給藥早期（第1、2周）采食量相對減少，體重增加亦較少。另外，從整個給藥試驗的前45d、后45d及90d的周均增重率來比較，所有試驗給藥的高、中、低劑量公、母鼠各組與空白對照組均無顯著差異，說明在大鼠適應含藥飼料后，應激寧對大鼠體增重沒有大的影響。試驗結束時，各試驗組公鼠的平均體重均比空白對照組低近30g，因為各組內標準差比較大，只有中劑量組的均重顯著低于空白組（P＜0.05），低劑量組和高劑量組與空白組差異不顯著。造成體重差異的原因，還是與各試驗組公鼠的采食量比空白組低有關，整個試驗期間空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組采食量分別為1,271.69g、1,124.76g、1,153.04g、1,199g，低劑量組的采食量最低，比空白組低近147g，同時添加中藥后飼料的能量和蛋白質含量相應降低，導致各試驗組大鼠試驗結束后體重比空白組低很多；因為添加更多的中藥中劑量組和高劑量組飼料的能量和蛋白質比低劑量組的更低，但是這兩組的采食量比低劑量的高、高劑量組的采食量比中劑量組的高，所以這三組的增重比較接近。

表2 對大鼠采食量、飲水量的影響（n=10）

表3 連續投喂45d對Wistar大鼠血液學及血液生化參數的影響（n=10）

2.3 對大鼠采食量和飲水量的影響

試驗期間對各組大鼠的采食量和飲水量進行統計分析，結果顯示：除第1周各給藥組公鼠的采食量顯著低于空白對照組（P＜0.05，這與大鼠對含藥飼料的適應性有關），各給藥組母鼠的采食量略低于空白對照組外，其余各周各給藥組公母鼠的采食量和飲水量與空白對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），詳細結果見表2。說明在大鼠適應含藥飼料后，應激寧對大鼠的采食量和飲水量沒有明顯影響。

表4 連續投喂90d對Wistar大鼠血液學及血液生化參數的影響（n=10）

2.4 對大鼠血常規和血液生化指標的影響

連續給藥45d和90d后，對各組一半大鼠的血液學指標和血液生化指標分別進行了檢測統計分析，結果顯示：各劑量組的血液學指標和血液生化指標測定值與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05），詳細結果見表3、表4。說明應激寧按高、中、低劑量混飼連續給藥90d，對大鼠血常規和血液生化指標未造成影響。

2.5 對大鼠主要臟器系數的影響

連續給藥45d和90d后，各組分別取一半大鼠撲殺，剖檢觀察、稱量主要臟器，統計分析各臟器系數。結果顯示：所有給藥組的各器官臟器系數與空白對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），詳細結果見表5。說明應激寧按高、中、低劑量混飼連續給藥90d，對大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、睪丸/卵巢子宮的生長發育均沒有影響。

2.6 對重要器官組織的病理影響

連續給藥45d和90d后，各組分別取一半大鼠采血后撲殺，肉眼觀察各組大鼠主要內臟器官，結果顯示：給藥的各劑量組和空白對照組大鼠的臟器均未發現異常病變。然后分別采集空白對照組和高劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃腸、睪丸或子宮組織用10%福爾馬林溶液固定，制作石蠟組織切片，經HE染色，顯微鏡觀察，亦未發現異常的組織病理學變化，詳見附圖。

3 結果分析

連續給藥90d應激寧各劑量組大鼠的增重率、攝食、血常規及血液生化指標與對照組相比，均未發生顯著性變化（P＞0.05）；剖檢和組織學觀察肝、腎、心、脾、肺、睪丸或子宮等重要器官組織均未發現異常的組織病理學變化。

4 結論

在試驗條件下，未發現應激寧對大鼠的生長發育產生不良影響，90d連續給藥無亞慢性毒性。體重的差異與采食量和攝入的能量及營養物質含量下降有關。

表5 對大鼠主要臟器系數的影響（n=10）