CypB在4NQO誘導SD大鼠頰黏膜癌變過程中的表達研究

陳雨荷 陳瀟 聶敏海 余麗 劉旭倩

親環素族(cyclophilins, Cyps)存在于原核生物至人類各種生物體中，表現肽酰-脯氨酸順/反異構酶(peptidyl-prolylisomerases, PPIase)生物學活性，充當分子伴侶。CypB(peptidyl-prolylcis-transisomerase B)是親環素家族中發現的第二個親環素蛋白，因 CypB具有PPIase活性，積極參與體內氧化應激反應并且對炎癥具有趨化作用，我們考慮CypB在口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)中發揮重要的作用。本文通過實驗檢測 CypB在口腔黏膜正常組織、惡變各期組織的表達情況，研究 CypB的表達與 OSCC發展過程的相關性。

1 資料與方法

1.1 實驗對象

隨機選取本課題組前期以4NQO誘導SD大鼠癌變建模后凍存的頰黏膜組織49 例，各切取約0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm固定、石蠟包埋后切片進行HE染色，由兩位有經驗的病理科醫生確定病理分級后分組，共收集到 SD大鼠正常頰鱗癌組(對照組)7 例，輕度上皮異常增生組(輕度組)6 例，中度上皮異常增生組(中度組)11 例，重度上皮異常增生組(重度組)9 例，頰鱗狀細胞癌組(鱗癌組)16 例。

1.2 實驗材料

兔抗鼠CypB單克隆抗體(武漢三鷹生物公司)； 兔抗鼠GAPDH單克隆抗體(北京Abway抗體技術公司)；免疫組化染色試劑盒和DAB試劑盒(北京中杉金橋生物公司)；總RNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司)；qPCR反轉錄試劑盒和SYBR?Green real time PCR master mix(TOYOBO，日本)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京Solarbio公司);ECL化學發光底物試劑盒(ABI，美國)；大鼠CypB引物(上海生工生物工程有限公司)；大鼠GAPDH引物(Invitrogen，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HE染色 脫蠟至水，分別置入蘇木素、鹽酸酒精、氨水、伊紅中染色，梯度酒精浸泡，最后置于二甲苯中，中性樹膠封片，由兩位有經驗病理科醫師讀片，根據2005 年WHO標準確定組織的病理分級。

1.3.2 IHC染色 脫蠟至水， 95 ℃ 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中抗原修復，按照免疫組化染色試劑盒、DAB試劑盒操作步驟染色，中性樹膠封片。

1.3.3 RT-qPCR 引物序列見表1。根據總RNA提取試劑盒提取各組組織中總RNA，測定各組RNA溶液濃度。65 ℃條件下變性5 min，根據RT-qPCR反轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，使用SYBR?Green real time PCR master mix試劑盒配制反應液，實時熒光定量PCR儀上機擴增，擴增條件：Hold Stage： 50 ℃， 2 min； 95 ℃， 10 min； PCR Stage(40 cycles)： 95 ℃， 20 s； 57 ℃， 20 s； 72 ℃， 31 s； Melt Curve Stage： 95 ℃， 15 s； 60 ℃， 1 min； 95 ℃， 30 s； 60 ℃， 15 s。根據公式計算2-△△CT，可視為4 組病變組織相較于對照組織中CypB mRNA表達量的對變化倍數。

1.3.4 Western blot 各組稱取100 mg剪碎于液氮研磨，加入1 ml組織裂解工作液，獲得各組CypB蛋白溶液。根據BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度。制備分離膠及濃縮膠，上樣后電泳轉膜，脫脂奶粉封閉液封閉1 h后，滴加CypB一抗液(1∶1 000)，TBST處理后滴加二抗液(1∶2 000)，避光，按照ECL化學發光底物試劑盒，滴加工作液上機顯影。

表 1 CypB、GAPDH引物序列

1.4 統計分析

SPSS 17.0統計軟件，檢驗5 組數據是否符合正態分布、方差齊性。行 one-way ANOVA，各組間比較行SNK-q檢驗。P<0.05為有差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 組織中CypB免疫組化結果

CypB主要在細胞質中表達， 陽性表達染色呈棕黃。在正常頰黏膜組中輕微著色，蛋白低、弱表達。隨病變程度增加，著色明顯，癌巢中呈強陽性(圖 1)。

2.2 正常及病變組織中CypB mRNA的表達

各組間比較，CypB mRNA相對表達量差異有統計學意義(P<0.05)。與正常頰黏膜組比較，輕度異常增生組 CypB mRNA的相對表達量上調1.16 倍，中度異常增生組上調1.33 倍，重度異常增生組上調1.53 倍，鱗狀細胞癌組上調1.93 倍。其相對表達量趨勢變化與SD大鼠誘癌后病變程度趨勢基本一致(圖 2)。

2.3 正常及病變組織中CypB蛋白的表達

CypB在病變組織中蛋白相對表達含量均比正常頰黏膜高(P<0.05)。輕度異常增生組CypB的蛋白相對表達量與中度異常增生組、重度異常增生組、鱗狀細胞癌組相比也具有統計學差異(P<0.05)， 中度上皮異常增生組與重度上皮異常增生組中無統計學意義(P>0.05)(圖 3～4)。 隨著SD大鼠誘癌后病變程度的進展，CypB蛋白相對表達量呈逐漸上升的趨勢，這與 RT-qPCR結果基本一致。

圖1 SD 大鼠頰黏膜組織免疫組化結果 (HE, ×100)

Fig 1 Immunohistochemical staining of buccal mucosa of SD rats (HE, ×100)

圖 2 SD 大鼠頰黏膜 CypB mRNA 的相對表達量

圖 4 Western blot 檢測 CypB 蛋白的表達

3 討 論

CypB常定位于內質網，CypB存在可切割的N端信號序列， 能夠引導合成中的蛋白質進入內質網，保護細胞抵抗內質網生理應激[1]。本實驗發現CypB在OSCC中高表達，并主要存在于細胞質中。這一結論與CypB在多種腫瘤中表達量增加一致， Choi 等[2]研究發現在結腸癌組織中 CypB mRNA和蛋白水平上也都呈過表達，且CypB高表達的患者的預后明顯較差。 Li 等[3]發現胃癌中CypB表達明顯高于非癌組織，這與Meng等[4]的研究結果一致，且CypB高表達與腫瘤的侵襲性顯著相關，在胃癌患者血清CypB濃度也明顯高于健康人。有研究發現多形性膠質母細胞瘤中CypB的表達最高，高于原代人星形膠質瘤細胞， 而非腫瘤腦的CypB表達最低[5]。也有學者發現肝癌患者組織CypB呈中高表達，正常肝組織中也存在表達但明顯降低[6]。本實驗又進一步行RT- qPCR、Western blot發現CypB相對表達含量的增長與癌變過程中組織惡性發展的趨勢一致，且在基因層面及蛋白層面均得以論證。

推測這一現象的原因，CypB具有PPIase活性，有利于蛋白質進行折疊、翻譯后修飾[7]。研究發現惡性腫瘤病理生理學變化可以改變蛋白折疊介導的信號傳導途徑，功能失調的蛋白發生蛋白折疊和重組途徑的改變又在惡性腫瘤中起著重要的作用[8]。

流行病學調查證實，OSCC經常受到持續的高風險行為的影響，如吸煙、飲酒和咀嚼檳榔[9]，這些行為會產生慢性氧化應激反應[10]。健康細胞能夠平衡活性氧(reactive oxygen species, ROS)的形成和消除，保持ROS-穩態[11]。當穩態受到干擾，就會發生氧化應激，引起細胞損傷，是多種疾病細胞損傷的機制[12]。研究表明氧化應激與多種癌癥的生長和侵襲性有關，適應氧化應激是腫瘤病理生理學的主要驅動力之一[13-14]。已明確氧化應激反應和CypB功能息息相關。CypB細胞表面有天然配體細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，CD147)，多種Cyps可與CD 147結合，啟動許多細胞內信號事件。有研究表明 CD147與 Cyps結合可促進腫瘤的發展，其介導方式與 ERK1/2通路有關[15]。過表達的 CypB與CD147結合可以保護肝癌細胞免受氧化應激，CypB表達下調使肝癌細胞更容易受到 ROS介導的凋亡，這種保護作用也依賴于CypB的PPIase活性[6]。但是近年也有學者提出異議，因為 Cyps中含量第一的CypA，其突變體 CypA/R55A在 PPIase活性上存在缺陷，卻仍能發揮抗氧化的作用，認為 CypA抗氧化的能力與 PPIase無關[16]。所以Cyps與氧化應激反應聯系密切，但生物學機制尚不清楚。

氧化應激產生的 ROS還能夠損害招募炎癥細胞，誘導細胞增殖或凋亡和致癌基因的表達。在OSCC的發生發展中，大量ROS可攻擊唾液蛋白，改變口腔黏膜結構，引起細胞周期畸變和細胞不規則分化，激活炎癥反應，OSCC微環境下炎癥標志物明顯增加[17-18]。CypB與炎癥反應也具有密不可分的關系。有研究證明 CypB可認為是炎癥的細胞間介質，CypB是有效的白細胞趨化因子，能夠通過聚集白細胞來啟動、加重炎癥反應，通過與 CD147結合途徑刺激基質金屬蛋白酶( MMP)產生，其相互作用能調節如急性肺部炎癥、膿毒癥、類風濕關節炎、心血管疾病等炎性疾病[19-22]。

綜上所述，本實驗從基因轉錄水平及蛋白水平研究表明在OSCC中CypB表達量明顯增高，這一結果與 CypB在多種癌癥中表達上調一致。隨著頰黏膜組織惡變程度加重，CypB相對表達含量呈逐漸升高。說明CypB水平變化與OSCC癌變發展過程密切相關。推測是由于 CypB的PPIase活性以及在氧化應激、炎性反應中的重要作用，本課題組考慮后續從該角度繼續深入研究CypB在OSCC發生、發展中的機制及作用。