基于瞬時納米沉淀法的球形納米粒子電荷及粒徑調控

劉靖康， 李 猛， 王銘緯， 徐益升,3

（1. 華東理工大學化工學院，上海 200237；2. 華東理工大學藥學院，上海 200237；3. 石河子大學材料化工工程技術中心，新疆 石河子 832000）

20 世紀80 年代以來，具有生物相容性的高分子材料制備的納米粒子（NPs）被廣泛用來輸送抗癌藥物。尺寸為10～200 nm 的納米粒子可以被動地通過高滲透長滯留效應（EPR）累積在腫瘤部位，又不至于被腎過濾排出體外[1-2]。研究表明，抗腫瘤藥物的納米載體的形狀、尺寸及表面電荷等因素對于腫瘤的治療效率有至關重要的影響[3-5]。納米粒子的傳統制備方法（如溶劑擴散法和透析法）是由熱力學控制的過程，因此通常需要花費較長的時間，并且所得納米粒子的大小難以控制。由于納米粒子的尺寸對于不同部位腫瘤治療的效率有著較大的影響[5]，因此，這也阻礙了納米粒子針對某種特定類型的癌癥的精準治療。

載藥納米粒子的表面電荷是另一個對治療效率有重要影響的參數。表面電荷對于納米載體在體內的循環壽命、在特定腫瘤部位的積累以及腫瘤細胞對于納米載體的吞噬效率等方面有重要影響[6-7]。通常，聚陽離子的藥物遞送系統具有優于大部分藥物遞送系統的巨大潛力，但是由于生物體內細胞膜上帶有大量的負電荷，帶有正電荷的載藥納米粒子會通過靜電作用吸附在細胞上，并與血液中的血清蛋白發生非特異性吸附，降低納米粒子在人體內的循環壽命[8]。因此需要對表面帶有正電荷的納米粒子進行調節，使其表面電荷具有一定的pH 響應性，在體內循環時表面不帶電甚至帶有微弱的負電荷，從而避免被吸附，而到達靶向部位時顯示正電荷，容易吸附于靶向位置進行給藥。一般來說，調節納米粒子表面電荷的手段主要有以下3 種：（1）在高分子載體的分子鏈上同時接入兩段帶有不同電荷的高分子嵌段，通過調節不同鏈段的相對長度調控納米粒子表面電荷[9]；（2）對高分子鏈進行功能化修飾，改變帶電荷的功能分子的接枝度，從而實現對納米粒子表面電荷的調控[10]；（3）通過酸不穩定的化學鍵在納米粒子表面接枝聚氧乙烯（PEG）基團，在適宜的pH 下，酸不穩定化學鍵斷裂，從而使納米粒子顯示內層基團所帶電荷[11-12]。但是，這3 種調節納米粒子表面電荷的方式只能通過合成不同的高分子化合物才能得到，限制了其應用。

瞬時納米沉淀法（FNP）是一種快速且簡單的制備納米粒子的方法[13-22]。溶有嵌段共聚物及有機功能分子的有機溶劑在毫秒級的時間內和水在多通道渦流混合器中快速混合，使有機溶質形成較高的過飽和度而促使其形成疏水的納米核心，雙親性嵌段共聚物的疏水段沉積在納米粒子表面，同時嵌段共聚物的親水段在納米粒子的表面形成親水的保護層阻止其相互聚集。與傳統方法（如透析法）制備納米粒子相比較，瞬時納米沉淀法不僅可以通過改變各液流流速、溶劑比及聚合物的濃度來系統調節納米粒子的尺寸、表面電荷及形貌[23-27]，而且該方法還可以極大縮短納米粒子的制備時間，進而可滿足工業化生產的需要。

在之前的工作中，作者成功使用FNP 技術制備了包載有生物熒光探針的棒狀納米粒子，并將其成功應用于小鼠體內成像[24]。在此基礎上，希望探索以此種方法制備疏水藥物納米粒子領域的更廣闊應用。以陽離子型嵌段共聚物聚甲基丙烯酸-2-（二甲氨基）乙酯-b-聚己內酯（PDMAEMA-b-PCL）以及生物相容性嵌段共聚物聚氧乙烯-b-聚己內酯（PEG-b-PCL）為穩定劑，通過FNP 技術制備了包載疏水藥物β-胡蘿卜素的球形載藥納米粒子。PDMAEMA-b-PCL 可以為納米粒子提供正電荷，而PEG-b-PCL 具有較高的生物相容性，PCL 可被生物體降解，同時膠束表面所形成的PEG 嵌段帶有微弱的負電荷，可以延長載藥納米粒子在生物體內的循環時間，因此被廣泛地應用于藥物輸送領域[28-29]。通過改變聚合物濃度、流速、溶劑比等條件可以準確控制納米粒子的表面電荷及尺寸。通過瞬時納米沉淀法制備的電荷可調載藥納米粒子在癌癥診斷和治療方面有潛在的應用價值。

1 實驗部分

1.1 實驗藥品與儀器

實驗藥品：β-胡蘿卜素，純度>97%（質量分數，下同），梯希愛（上海）化成工業發展有限公司（TCI）；乙二醇，w=99%，上海泰坦科技股份有限公司；2-溴代異丁酰溴，純度98%，上海阿達瑪斯試劑公司；三乙胺，純度99%，北京百靈威科技有限公司；二氯甲烷，純度99%，上海泰坦科技股份有限公司；氫化鈣，純度>97%，上海天蓮精細化工有限公司；ε-己內酯，純度99%，上海阿達瑪斯試劑公司；辛酸亞錫，純度95%，百靈威科技有限公司；四氫呋喃，純度99%，上海天蓮精細化工有限公司；五甲基二乙烯三胺，純度99%，美國Sigma-Aldrich 公司；甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，純度97%，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司（TCI）；苯基甲基醚，純度99%，上海麥克林生化科技有限公司；氯化亞銅，純度97%，上海天蓮精細化工有限公司；氯化銅，純度98%，上海天蓮精細化工有限公司；正己烷，純度97%，上海泰坦科技股份有限公司；高純氮，上海思靈氣體有限公司；文中所用去離子水為實驗室自制。

儀器：恒溫磁力攪拌器，HS-7 型，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；旋轉蒸發儀，RV8 型，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；電子天平，ME204E 型，梅特勒-托利多（上海）儀器公司；真空干燥箱，DZF-6020 型，上海一恒儀器設備有限公司；注射泵，PHD 2000 型，豪沃生物科技（上海）有限公司；pH 計，Delta320 型，梅特勒-托利多（上海）儀器公司；動態光散射激光粒度儀，NICOMP 380ZLS 型，美國PSS 粒度儀公司；凝膠滲透色譜儀，GPC50 型，英國Polymer Laboratories公司；核磁共振儀，AM400 MHz，布魯克(北京)科技有限公司；紫外分光光度計，UV-2550 型，島津(上海)實驗器材有限公司；透射電子顯微鏡（TEM），JEM-1400 型，日本電子株式會社（JEOL）。

小分子引發劑，相對分子量為8 000?7 000 的嵌段共聚物PDMAEMA-b-PCL的合成步驟及表征見文獻[24]，嵌段共聚物PEG-b-PCL 由組內付智楠博士提供，兩嵌段的相對分子量均為5 000。

1.2 納米粒子的制備

通過FNP 制備納米粒子，四通道渦流混合器（MIVM）及其內部結構如圖1(a)所示，納米粒子的制備過程見圖1(b)。進料1 為有機相，其溶劑為四氫呋喃，溶質包括質量濃度為0.2 mg/mL 的 β -胡蘿卜素和總質量濃度為2.0 mg/mL 的兩種嵌段共聚物PEGb -PCL、PDMAEMA- b -PCL；進料2、3 和4 均為去離子水。4 股進料中：進料1 與進料2 流速相同，標記為v1，進料3 與進料4 流速相同，標記為v2。使用2 臺注射泵推動4 股進料在MIVM 中劇烈混合，得到含有納米粒子的混合溶液(混合時v1調節范圍為6～24 mL/min，v2調節范圍為24～96 mL/min)，再使用去離子水透析12 h 得到所需納米粒子水溶液。僅使用1 種嵌段共聚物（PEG-b-PCL 或PDMAEMA-b-PCL），制備出的納米粒子分別標記為PEG NPs 或PDMAEMA NPs，使用2 種嵌段共聚制備出的納米粒子標記為PEG/PDMAEMA NPs。調節所得納米粒子溶液pH 使用的HCl 和NaOH 濃度分別為0.01、0.1 mol/L。所制備的納米粒子包封率（EE）依據文獻[26]中方法測試。

圖1 通過FNP 制備納米粒子：(a) 四通道渦流混合器及其內部結構；(b) 納米粒子制備流程圖Fig. 1 Preparation of NPs using FNP: (a) Multi-inlet vortex mixer and its internal structure; (b) Schematic illustration of NPs preparation

1.3 納米粒子的測試及表征

使用動態光散射激光粒度儀表征制備出的球形納米粒子的尺寸、分散性及Zeta 電位。測試溫度為23 ℃，散射角固定為90°，測試介質為去離子水，在23℃下，去 離 子 水 黏 度 為0.933 mPa·s，折 光 率 為1.333。表面電荷測試介質為去離子水，電極間距為0.4 cm，電極間電壓為5 V，介電常數為78.5。紫外吸收光譜使用島津紫外分光光度計進行測試，使用透射電子顯微鏡表征所制備的納米粒子的形貌。

2 結果與討論

2.1 聚合物進料質量濃度比對納米粒子表面電荷及粒徑調控

保持嵌段共聚物總質量濃度為2.0 mg/mL，β-胡蘿卜素質量濃度為0.2 mg/mL，進料1、2 流速v1為12 mL/min，進料3、4 流速v2為48 mL/min，改變不同嵌段共聚物質量濃度比，考察不同進料質量濃度比對于納米粒子表面電荷及粒徑的影響。按不同嵌段共聚物質量濃度比制備的納米粒子在pH=5.5 時的粒徑（Dh）、分散性（PDI）及包封率列于表1，不同pH 下的Zeta 電位及粒徑如圖2 所示。

如表1 所示，按不同嵌段共聚物進料質量濃度比制備的納米粒子的分散性均在0.3 左右，分散性較好。pH=5.5 時，對于不同嵌段共聚物制備的納米粒子單一的嵌段共聚物所形成納米粒子，PEG NPs 粒徑要小于PDMAEMA NPs 的粒徑。所得納米粒子的粒徑隨著PDMAEMA-b-PCL 的增多逐漸增大，這可能是由于兩種不同嵌段共聚物的不同親水鏈段的親水性不同，因而其疏水鏈段在納米粒子的β-胡蘿卜素核心表面沉積的速度不同，從而導致其粒徑不同。所制備的納米粒子對于胡蘿卜的包封率均高于60%，顯示出較高的包封率。

表1 聚合物不同質量濃度比制備的納米粒子在pH=5.5 時的粒徑、分散性及包封率Table 1 Particle size, PDI and encapsulation efficiency of nanoparticles made by different polymer mass concentration ratio at pH = 5.5

由圖2 可見，單獨的PEG NPs 在pH=5.5 時表面電位為?4.7 mV，顯示出微弱的負電性，這是由于PEG 嵌段作為引發劑引發ε-己內酯開環聚合后留下的?OH 基團及ε-己內酯單體之間相連的酯基水化而使納米粒子表面帶有微弱的負電荷[9,30]。pH 在5.5～8.5 之間變化時，其電位及粒徑保持相對穩定。而單獨的PDMAEMA NPs 在pH=5.5 時電位為+32.4 mV，顯示出較為強烈的正電性，這是由于PDMAEMA嵌段上含有大量的胺基，其易于發生質子化而使形成的納米粒子表面一直帶正電。且在pH 由5.5 調整至8.5 的過程中，納米粒子表面的電荷由+32.4 mV 降低至+17.8 mV，同時納米粒子的粒徑由107.1 nm 下降至69.3 nm。這是由于在pH 增大時，PDMAEMA嵌段的胺基發生去質子化，因此納米粒子表面電荷減少；同時由于胺基的去質子化導致PDMAEMA 嵌段親水性下降，從而PDMAEMA 鏈段發生皺縮，納米粒子的粒徑隨pH 的增大而下降。

圖2 不同pH 下，聚合物不同質量濃度比下制備的球形納米粒子的Zeta 電位和粒徑Fig. 2 Zeta potential and diameter of spherical nanoparticles prepared with different polymer mass concentration ratios at various pH values

當使用PDMAEMA-b-PCL 與PEG-b-PCL 兩種嵌段共聚物制備納米粒子時，制備出的納米粒子的電位和粒徑會隨嵌段共聚物PEG-b-PCL 的增加分別由+32.4 mV 和107.1 nm 減 小 至?4.7 mV 和64.9 nm（pH=5.5）。這是由于嵌段共聚物的總質量恒定，當嵌段共聚物PEG-b-PCL 的質量比增大時，會相應地減少納米粒子表面的PDMAEMA 嵌段的量，納米粒子表面胺基減少，因此使制備的納米粒子表面電位降低。通過調節兩種嵌段共聚物的質量比即可對所制備的納米粒子表面胺基的量進行控制，從而實現對制備的納 米 粒子表面電荷 在+32.4 mV 至?4.7 mV之間進行精準的調控（pH=5.5）。

2.2 進料流速對納米粒子表面電荷及粒徑調控

制備的電荷可調納米粒子PEG/PDMAEMA NPs 可通過調節流速比及絕對流速來調節納米粒子的尺寸。其中嵌段共聚物PDMAEMA-b-PCL 與PEG-b-PCL 質量濃度均為1.0 mg/mL，β-胡蘿卜素質量濃度為0.2 mg/mL。

圖3 不同pH、不同流速比下制備的球形納米粒子的Zeta 電位及粒徑Fig. 3 Zeta potential and particle diameter of the synthesized NPs by changing v1:v2 at various pH values

2.2.1 不同流速比 將進料1、2 的流速v1固定在12 mL/min，進料3、4 的流速v2由24、48、72 mL/min逐漸增大至96 mL/min，由圖3 所示，在pH 由5.5 調節至8.5 過程中，各流速比下制備的納米粒子的表面電荷均由+25 mV 左右（pH=5.5）下降至+3 mV 左右（pH=8.5）。在相同pH 下，通過不同流速比制備的納米粒子表面電荷基本相等，說明納米粒子表面電荷只與不同嵌段共聚物的進料質量濃度比相關，與不同進料口處的流速比無關。保持v1不變，v2由24 mL/min增大至96 mL/min 過程中，納米粒子的尺寸由126.6 nm（pH=5.5）減小至62.7 nm（pH=5.5）。這是由于當水的相對流速更大時，疏水的β-胡蘿卜素在混合的溶液中過飽和度更高，因此會有更多的成核位點形成；同時，在更大的水流速下各進料在混合腔中停留時間較短，納米粒子的生長時間相應較少，所以使得到的納米粒子尺寸更小[18,24]。不同流速比下制備的納米粒子在pH 為5.5～8.5 內調節時其粒徑及分散性均保持穩定。

2.2.2 不同絕對流速 除調節進入混合器中各物料的流速比外，提高進入混合器各物料的絕對流速而保持其流速比相同也可調節所得納米粒子的粒徑。選用同一流速比（v1∶v2=1∶4），增大其絕對流速，考察絕對流速對于納米粒子尺寸及表面電荷的影響，所得結果如圖4 所示。當絕對流速增大時，所得納米粒子粒徑由107.5 nm（pH=5.5）減小至77.3 nm (pH=5.5)。而在相同pH 下，不同絕對流速下制備的納米粒子的表面電荷基本相等。這與不同流速比的實驗結果相似。在相同的流速比下，各混合腔內的過飽和度相同，較大的流速使納米粒子粒徑較小，可能是由于在更高的流速下各液體混合得更加均勻，且較高的流速下混合液體在混合腔中停留的時間較短，納米粒子的生長時間也相應減小，液體的混合時間大于納米粒子的生長時間[13]，使所得納米粒子的粒徑隨絕對流速的增加而減小。

圖4 相同流速比(v1:v2=1:4)、不同流速下制備的球形納米粒子在不同pH 下的Zeta 電位及粒徑Fig. 4 Zeta potential and particle diameter of the synthesized NPs by changing flow rate of v1,v2(keeping v1:v2=1:4 ) at different pH values

2.3 球形納米粒子穩定性和形貌表征

使用動態光散射激光粒度儀監測球形納米粒子在近一個月內粒徑的變化，如圖5(a)所示，制備條件： v1=12 mL/min， v2=48 mL/min； ρ(PEG-b-PCL)=ρ (PDMAEMA-b-PCL)=1 mg/mL, ρ (β-carotene)=0.2 mg/mL。所制備的PEG/PDMAEMA NPs 在pH=7.4 的條件下保存近一個月，其粒徑穩定在70 nm 左右，未發生明顯變化，穩定性良好。

圖5 (a) pH=7.4 時PEG/PDMAEMA NPs 粒 徑 隨 時 間 的變化；(b) PEG/PDMAEMA NPs 的TEM 圖Fig. 5 (a) Variations of particle diameter of PEG/PDMAEMA NPs with time at pH = 7.4; (b) TEM image of PEG/PDMAEMA NPs

使 用TEM 表 征 了PEG/PDMAEMA NPs 的 形貌，如圖5(b)所示，所制備的PEG/PDMAEMA NPs為均一的球形，其粒徑大小約為60 nm，與動態光散射激光粒度儀測試的粒徑接近。這一尺寸的納米粒子既不會由于尺寸過小而被腎過濾出體外，又可以通過高滲透長滯留效應在腫瘤部位積累，適合作為疏水性藥物的納米載體。

3 結 論

（1）通過瞬時納米沉淀法，使用PEG-b-PCL 和PDMAEMA-b-PCL 兩種嵌段共聚物及β-胡蘿卜素在MIVM 混合器中劇烈混合制備表面電荷可調的球形納米粒子。

（2）通過改變嵌段共聚物的進料比使納米粒子的表面電荷在單一的PDMAEMA NPs 時的+32.4 mV至單一PEG NPs 的?4.7 mV 間連續調節（pH=5.5）。

（3）納米粒子表面電荷具有一定的pH 響應性，隨pH 的增大，納米粒子表面電荷減小，同時隨著PEG-b-PCL 的增多，納米粒子表面電荷調節范圍減小。

（4）納米粒子的粒徑可通過調節流速及流速比系統地進行調節：當流速比v1∶v2由12∶24 至12∶96，納米粒子尺寸由126.6 nm 減小至62.7 nm；當流速比為1∶4 不變，而絕對流速增大時（v1為6，12，24；v2為24，48，96），納米粒子的尺寸由107.5 nm減小至77.3 nm。

（5）制備出的納米粒子粒徑在25 d 穩定在70 nm左右，穩定性良好。

（6）通過瞬時納米沉淀法這一策略可以快速制備電荷可調球形納米粒子，且對其粒徑及表面電荷可以進行準確的調控，在未來癌癥診斷和治療方面有潛在的應用價值。