年輕女性乳腺癌潛在核心基因的生物信息學分析

陶 然，趙衛紅，秦博宇，焦順昌

解放軍總醫院第一醫學中心 腫瘤內科，北京 100853

乳腺癌是世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命健康。近年來與西方發達國家比較，我國女性乳腺癌發病率和死亡率快速上升，且呈現出年輕化趨勢[1]。與中老年女性乳腺癌相比，年輕乳腺癌患者(≤35歲)就診時病理學分期更晚、組織學分級更高、侵襲性更強，同時也更容易出現多器官轉移及骨髓侵犯[2-4]。由于該年齡段患者數量的限制，目前針對年輕女性乳腺癌相關基因的分子生物學功能及通路分析國內外鮮有報道。本研究通過生物信息學方法處理醫學癌癥數據庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中年輕女性乳腺癌相關轉錄組數據，篩選出差異表達基因的同時構建蛋白質相互作用網絡，并著重對網絡中表達上調的核心基因進行分析。初步探索年輕女性乳腺癌在分子水平的發生發展機制。

資料與方法

1 資料 通過TCGA數據庫(https：//gdc-portal.nci.nig.gov)下載女性乳腺癌相關轉錄組數據集(RNA-seq v2 level3)，檢測平臺均為Illumina HiSeq 2000 RNA Sequencing。在保留篩選條件為年齡≤35歲的樣本數據后共得到了32例樣本，其中包括29例腫瘤組織樣本和3例正常乳腺組織樣本。

2 差異表達基因篩選 采用R3.4.1中的Limma程序包(Version 3.32.5)對TCGA數據庫中年輕女性乳腺癌轉錄組數據集歸一化處理并與正常乳腺組織的基因表達值進行比對篩選差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)。對篩選出的差異表達基因采用R3.4.1中的Pheatmap Version 1.0.8包繪制火山圖以及雙向層次聚類熱圖。差異表達基因篩選條件為|log2FC|＞0.5同時FDR＜0.05。

3 蛋白質相互作用網絡構建及核心基因篩選利用蛋白質相互作用數據庫STRING(Version：10.0，https：//string-db.org)構建差異表達基因編碼蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction network，PPI)。通過Cytoscape Version 3.6.1對網絡進行可視化展示。進一步利用Cytoscape軟件中的MCODE(Molecular Complex Detection)插件篩選網絡中與年輕女性乳腺癌顯著相關的核心基因。

4 核心基因的GO功能及KEGG通路分析 著重對網絡中表達上調的核心基因進行基于DAVID6.8在線分析工具的基因本體(gene ontology，GO)功能與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。并通過超幾何分布Fisher exact檢驗計算顯著性水平(顯著性篩選標準：P＜0.05)。

結 果

1 差異表達基因篩選 對年輕女性乳腺癌腫瘤組織及正常組織基因數據采用Limma程序包進行預處理及篩選，共得到720個滿足設定閾值(|log2FC|＞0.5且FDR＜0.05)的差異表達基因。對比正常組織，癌組織中上調基因173個，下調基因547個(圖1)。

2 編碼蛋白質相互作用網絡構建及篩選核心基因利用STRING數據庫對篩選出的720個差異表達基因進行分析處理，在保留相互作用預測得分高于0.4的作用對后共得到了1 061對連接對，以此構建差異表達基因編碼蛋白質相互作用網絡并使用Cytoscape對網絡進行可視化展示(圖2A)。通過MCODE(Molecular Complex Detection)插件對該蛋白質相互作用網絡進行分析，得出兩個核心基因模塊，進一步篩選出核心基因NCAPG、NCAPH、MELK、PBK、CDCA5、CDCA8、CCNB2、CCNA2、SPC25、SKA1、NPY1R、CXCL9、CXCL10、GALR2、CCR8、CXCL2、CXCL3、CXCL5、PPBP、CCL16。 其 中 NCAPG、NCAPH、MELK、PBK、CDCA5、CDCA8、CCNB2、CCNA2、SPC25、SKA1、NPY1R、CXCL9、CXCL10、GALR2、CCR8在年輕女性乳腺癌腫瘤組織中表達上調，CXCL2、CXCL3、CXCL5、PPBP、CCL16在 腫 瘤組織中表達下調(圖2B)。

3 核心基因的功能及通路分析 著重對網絡中表達上調的核心基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。結果顯示上調核心基因主要參與有絲分裂、細胞增殖正向調控和免疫應答等生物學過程，同時與趨化因子信號通路以及神經活性配體-受體相互作用等KEGG信號通路關系密切(圖3)。

討 論

圖1 差異表達基因火山圖(A)及表達水平雙向層次聚類熱圖(B)藍點為差異表達基因Fig. 1 Volcano map (A) and Heatmap of DEGs (B)Blue dots represent the DEGs

本研究通過對年輕女性乳腺癌腫瘤組織及正常乳腺組織的轉錄組數據分析，共篩選得到720個差異表達基因，其中上調基因173個，下調基因547個。進一步構建差異表達基因編碼蛋白質相互作用網絡，最終得到與年輕女性乳腺癌顯著相關的核心基因NCAPG、NCAPH、MELK、PBK、CDCA5、CDCA8、CCNB2、CCNA2、SPC25、SKA1、NPY1R、CXCL9、CXCL10、GALR2、CCR8、CXCL2、CXCL3、CXCL5、PPBP、CCL16。以上核心基因中NCAPG、NCAPH、MELK、PBK、CDCA5、CDCA8、CCNB2、CCNA2、SPC25、SKA1、NPY1R、CXCL9、CXCL10、GALR2、CCR8在年輕女性乳腺癌組織中表達上調，CXCL2、CXCL3、CXCL5、PPBP、CCL16在 癌 組織中表達下調。著重對表達上調的核心基因進行GO與KEGG富集分析，顯示有絲分裂、細胞增殖正向調控和免疫應答等生物學功能與其存在顯著相關性，同時趨化因子以及神經活性配體-受體相互作用等信號通路與表達上調核心基因關系密切。

圖3 蛋白質相互作用網絡中上調核心基因的GO和KEGG通路分析Fig. 3 GO and KEGG pathway analysis of up-regulated critical genes in protein-protein interaction network hsa: homo sapiens； MF: molecular function； CC: cellular component； BP: biological process

非染色體結構維護凝縮蛋白Ⅰ復合體G亞基 (non-SMC condensingⅠcomplex subunit G，NCAPG)是凝縮蛋白復合物Ⅰ中的一個SMC調節亞基。既往研究初步證實NCAPG可能通過PI3K/AKT信號系統參與了多種腫瘤的發病過程并與預后不良相關[5-6]。利用siRNA-NCPAG技術可顯著抑制腫瘤細胞的增殖率及侵襲程度[7]。非染色體結構維護凝縮蛋白Ⅰ復合體H亞基(non-SMC condensingⅠcomplex subunit H，NCAPH)作為另一種SMC調節亞基，是拓撲異構酶Ⅱ(TopoisomeraseⅡ)活性的重要調控元件。NCPAH在黑色素瘤中可促進DNA修復和細胞周期蛋白表達上調，同時在非小細胞肺癌中NCAPH的過表達與預后不良相關[8-9]。

細胞周期蛋白A2(CCNA2)和細胞周期蛋白B2(CCNB2)通常與細胞增殖密切相關，研究表明CCNA2缺失會抑制不同類型惡性腫瘤的發生[10]，CCNB2則在惡性腫瘤中廣泛過表達[11]。細胞分裂周期相關蛋白5(cell division cycle-associated 5，CDCA5)作為細胞周期的核心調節因子被證實在肺癌發生過程中存在表達水平升高且與預后不良相關[12]。細胞分裂周期相關蛋白8(cell division cycle-associated 8，CDCA8)是染色體乘客復合體(chromosomal passenger complex，CPC)的組成部分，對CDCA8基因分析結果顯示其在人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)和腫瘤細胞中高表達，在正常細胞中弱或無表達[13]。

PDZ連接激酶/T-LAK細胞源蛋白激酶(PDZ-binding kinase/T-LAKcell-originatedproteinkinase，PBK/TOPK)是絲裂原活化蛋白激酶激酶(mi-togen activated protein kinasee，MAPK)家 族 的 絲 -蘇氨酸激酶。PBK/TOPK在乳腺癌中可激活p38及MAPK信號通路促進腫瘤細胞增殖[14]，在肺癌中通過激活PI3K/PTEN/AKT通路促進上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)， 最 終 導致腫瘤細胞遷移[15]。

紡錘體和動粒關聯蛋白-1(spindle and kinetochore-as-sociated complex subunit1，SKA1)是SKA蛋白復合體的成員，病理條件下SKA1可通過加快細胞周期檢查點轉換誘導腫瘤細胞增殖。目前證實SKA1在惡性腫瘤組織中表達增高且與腫瘤臨床分期密切相關[16]。Spc25(Spindle pole body compo-nent 25 homol)是核分裂周期蛋白80(nuclear division cycle 80，Ndc80)復合體的組成成員。初步報道Spc25在CpG島甲基化表型(CIMP)陽性腎細胞癌中表達升高，同時在某些特殊病理類型乳腺癌基底部位高表達且與生存率相關[17-18]，其意義仍有待進一步明確。

神經肽Y1受體(neuropeptide Y1 receptor，NPY1R)參與調節垂體激素的合成與分泌。實驗證實經雌激素處理過的大鼠下丘腦中NPY1R-mRNA轉錄水平上升，同時NPY1R可通過調控雌激素分泌進一步誘導乳腺癌細胞增殖[19]。近期報道甘丙肽(galanin，GAL)及其受體系統(galanin receptor，GALR)與腫瘤發生發展密切相關。乳腺癌中甘丙肽前體基因(11q13)位點發生經常性擴增，同時GAL蛋白表達水平受雌激素分泌影響[20]，提示其在腫瘤分子診斷方面的潛在價值。

母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶(maternal embryonic leucine zipper kinase，MELK)是AMPK/snf1蛋白激酶家族的一種性絲-蘇氨酸激酶。沉默MELK會增加p53的表達水平[21]，同時MELK抑制劑通過誘導p21表達，控制細胞在G1期停滯從而抑制腫瘤細胞增殖[22]。目前MELK基因已成為抗癌藥物研發中的熱門靶點。

趨化因子受體8(chemokine receptor 8，CCR8)作為G蛋白偶聯受體家族成員是CC類趨化因子CCL1的唯一受體。CCR8主要在淋巴組織中表達，近期研究認為腫瘤細胞可通過其表面的CCR8受體與CCL1結合促進淋巴轉移[23]，乳腺癌組織中的CCR8高表達與患者總體不良預后相 關[24]。CXCL9(monokine induced by IFN-γ)和CXCL10(IFN-γ-inducible protein 10)是 由 IFN-γ誘導產生的ELR-(Glu-Leu-Arg)CXC類趨化因子，在抑制腫瘤血管生成的同時通過上調淋巴細胞黏附分子誘導多種免疫細胞遷移至腫瘤組織發揮殺傷作用[25-26]。小鼠腫瘤免疫模型研究發現抗PD-L1治療反應率高的腫瘤組織中CXCL9、CXCL10表達水平升高[27]，提示對未來抗腫瘤免疫治療的療效預測具有潛在價值。

值得注意的是，本研究同時篩選出5個表達下調核心基因。其中CXCL2、CXCL3和CXCL5均為ELR+CXC類趨化因子，可作為血管生成因子從而誘導腫瘤組織內血管生成[28]。血小板堿性蛋白(pro-platelet basic protein，PPBP)參與調節有絲分裂、cAMP胞內聚集以及DNA合成等細胞生物學過程。CCL16/HCC4作為CC類趨化因子的成員，主要在巨噬細胞炎癥歸巢過程中發揮關鍵作用。目前關于這5個下調基因及其編碼蛋白在腫瘤發生與發展機制中的相關性研究報道尚少，有待后續進一步探索。

綜上所述，本研究基于生物信息學方法對年輕女性乳腺癌潛在核心基因進行了初步分析探索。由于目前醫學癌癥數據庫中年輕女性乳腺癌相關數據較為有限，篩選出的核心基因仍需通過大量的基礎實驗及臨床研究進一步證實。但本研究依然有助于增強對年輕女性乳腺癌相關分子機制的了解，同時為該疾病的臨床診斷與治療提供了一定的理論基礎。