基于生物信息學(xué)篩選漿液性卵巢癌的預(yù)后基因

張明潔，史菲菲，何嘉歡，劉紅彥

(河南大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州)

0 引言

卵巢癌(ovarian cancer, OC)是我國(guó)第三大婦科惡性腫瘤，其致死率極高[1]。漿液性卵巢癌是OC最常見的組織學(xué)類型，約占70%[2]。由于OC早期缺乏有效的篩查方法，因此得到確診時(shí)通常是疾病晚期，5年生存率僅為30%～40%[3]。目前卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，用于診斷疾病發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)記物也有限[4]。因此，對(duì)OC相關(guān)的特定生物標(biāo)志和信號(hào)通路研究將有助于揭示OC的分子發(fā)病機(jī)制，改善患者預(yù)后。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載不同的基因數(shù)據(jù)集，采用GEO2R篩選出漿液性卵巢癌的差異表達(dá)基因并對(duì)其進(jìn)行一系列分析，篩選出關(guān)鍵基因并分析其與患者總生存期關(guān)系，為漿液性卵巢癌分子機(jī)制的深入研究和診療策略的制定提供一定的理論依據(jù)。

1 研究材料和方法

1.1 研究材料

GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)是免費(fèi)的微陣列芯片和基因譜數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)[5](http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)篩選數(shù)據(jù)集GSE36668[6]、GSE54388[7]、GSE38666[8]。GSE36668包含4個(gè)漿液性卵巢癌組織樣本和4個(gè)正常卵巢組織樣本，GSE54388包含16個(gè)漿液性卵巢癌組織樣本和6個(gè)正常卵巢組織樣本，GSE38666包含18個(gè)漿液性卵巢癌組織樣本和12個(gè)正常卵巢組織樣本，如圖1。

1.2 篩選DEGS

采用GEO自帶分析軟件GEO2R[9](http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)對(duì)GSE36668、GSE54388、GSE38666基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，以P＜0.05，|log (FC)| ＞1為標(biāo)準(zhǔn)篩選漿液性卵巢癌組織和正常卵巢組織的差異表達(dá)基因(differential methylation gene, DEGS)。然后采用Venny2.1.0[10](https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具重疊三個(gè)數(shù)據(jù)集之間的DEGS。

圖1 GSE36668、GSE54388、GSE38666基因數(shù)據(jù)集樣本

圖2 A.上調(diào)差異表達(dá)基因B.下調(diào)差異表達(dá)基因

1.3 功能富集分析

DAVID(functional Annotation bioinformatics microarray analysis, http：//david .abcc.ncifcrf.gov/)是一個(gè)功能注釋工具綜合數(shù)據(jù)庫(kù)[11]。為了更加深入了解DEGS的功能，本研究應(yīng)用DAVID對(duì)DEGS分別進(jìn)行GO(gene ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，P值＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和Hub基因篩選

采 用STRING[12](search tool for the retrieval of interacting genes, https：//stringdb.org/)在 線 工 具 構(gòu) 建DEGS的蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)，中心度分?jǐn)?shù)＞0.4被認(rèn)為是重要的。輸出TVS格式，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.5.1軟件[13](http：//www.cytoscape.org/download.php)。隨后在Cytoscape軟件引入插件cytoHuba篩選PPI網(wǎng)絡(luò)的Hub基因，同時(shí)應(yīng)用插件MCODE構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的功能模塊。

1.5 Hub基因的表達(dá)分析和生存分析

GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)是用于癌癥和正常基因表達(dá)譜分析及交互式分析的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器[14]。我們利用GEPIA在人體圖中進(jìn)行了腫瘤組織和正常組織樣本的中值表達(dá)分析。Kaplan-Meier是用于評(píng)估ECA、TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)基因?qū)ι娴挠绊懙囊环N常用網(wǎng)絡(luò)工具[15]。本研究采用Kaplan-Meier方法探索Hub基因與漿液性卵巢癌患者總生存率之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 篩選DEGS

通過(guò)GEO2R在線工具，本研究從GSE36668基因數(shù)據(jù)集的漿液性卵巢癌組織和正常卵巢組織中篩選出6504個(gè)DEGS，其中包括3296個(gè)上調(diào)和3208個(gè)下調(diào)的DEGS；從GSE54388基因數(shù)據(jù)集篩選出3592個(gè)DEGS，包括2134個(gè)上調(diào)和1458個(gè)下調(diào)的DEGS；從GSE38666基因數(shù)據(jù)集篩選出12450個(gè)DEGS，包括9506個(gè)上調(diào)和2944個(gè)下調(diào)的DEGS。重疊三個(gè)數(shù)據(jù)集的上調(diào)DEGS獲得867個(gè)上調(diào)的DEGS；重疊三個(gè)數(shù)據(jù)集的下調(diào)DEGS獲得616個(gè)下調(diào)的DEGS。Venny圖見圖2。

2.2 GO功能和KEGG通路富集分析

為了進(jìn)一步研究DEGS在漿液性卵巢癌的功能，采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)全部DEGS進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)的DEGS主要在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)表達(dá)，參與細(xì)胞分裂、姐妹染色的單體的凝聚力、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞的黏附等生物學(xué)過(guò)程；下調(diào)的DEGS主要在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)外來(lái)體等結(jié)構(gòu)表達(dá)，參與轉(zhuǎn)錄正負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)結(jié)合、特定DNA序列結(jié)合、鋅離子結(jié)合等生物過(guò)程(表1)。上調(diào)差異表達(dá)基因KEGG通路富集在細(xì)胞周期、癌癥、抗生素生物合成、代謝和PI3K-Akt信號(hào)通路；下調(diào)差異表達(dá)基因KEGG通路富集在干細(xì)胞功能性調(diào)控、癌癥、蛋白聚糖和黏著斑等信號(hào)通路(表2)。

表1 與漿液性卵巢癌相關(guān)的差異表達(dá)基因的主要GO富集分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和Hub基因篩選

采用STRING和Cytoscape繪制DEGS的PPI網(wǎng)絡(luò)并圖像可視化(圖3A)。采用插件MCODE篩選PPI功能模塊(圖3B)。運(yùn)用插件CytoHubba篩選 出10個(gè)Hub基 因，包 含AKT1、GAPDH、CKD1、CCNB1、CDC20、BRCA1、CCNA2、AURKB、TOP2A、MAD2L1(圖4)。

2.4 表達(dá)分析及生存分析

在人體圖中腫瘤和正常樣品的中值表達(dá)顯示了CDC20、AURKB、CCNB1、AKT1和GAPDH的表達(dá)情況(圖5)。采用Kaplan-Meier方法評(píng)估Hub基因與漿液性卵巢癌患者的預(yù)后關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CDC20(P=0.015)、AURKB(P=0.039)、CCNB1(P=0.019)、AKT1(P=0.0031)和GAPDH(P=0.041)的高表達(dá)與漿液性卵巢癌患者預(yù)后不良相關(guān)(圖6)。我們推測(cè)，CDC20、AURKB、CCNB1、AKT1和GAPDH基因可能是漿液性卵巢癌預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)記物。

3 討論

圖3 DEGS的PPI網(wǎng)絡(luò)（A）和頂級(jí)模塊（B）

圖4 針對(duì)漿液性卵巢癌組織和正常組織，采用CytoHubba插件篩選出10個(gè)Hub基因，A.紅色表示高富集，黃色表示低富集，B.Hub基因的度值

表2 與漿液性卵巢癌相關(guān)的差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中最常見的死亡原因，盡管卵巢癌通常對(duì)鉑類化合物和紫杉烷類藥物的一線化療藥物反應(yīng)良好，但大多數(shù)患者會(huì)復(fù)發(fā)并產(chǎn)生化學(xué)耐藥性[16]。因此，了解該病的特定生物標(biāo)志對(duì)于疾病的早期診斷和治療至關(guān)重要。

本研究表明，CDC20、AURKB、CCNB1、AKT1及GAPDH基因是卵巢癌差異表達(dá)中的上調(diào)基因，其過(guò)表達(dá)與卵巢癌患者的預(yù)后差相關(guān)。CDC20(細(xì)胞分裂周期20)是細(xì)胞有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物APC活化所需的紡錘體組裝檢查點(diǎn)分子，從而調(diào)控染色體單體分離，使細(xì)胞分裂進(jìn)入分裂后期[17,18]。研究表明，CDC20的敲低可降低胰腺腫瘤細(xì)胞[19]和肝癌細(xì)胞[20]的增殖并誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期停滯。CDC20也被認(rèn)為與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)，如結(jié)直腸癌[21]、胰腺癌[22]、肺癌[23]和乳腺癌[24]。AURKB(極光激酶B)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要參與調(diào)控細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程[25]。研究證明，AURKB在多種惡性腫瘤如結(jié)直腸癌[26]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[27]和肺癌[28]細(xì)胞中高表達(dá)。CCNB1的高表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如膀胱癌[29]，大腸癌[30]，乳腺癌[31]和垂體腺瘤[32]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AKT1基因E17K是乳腺癌的潛在生物標(biāo)志[33]；AKT1基因在骨肉瘤組織中高表達(dá)，敲低該基因可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[34]；是硬化性肺細(xì)胞瘤的遺傳標(biāo)志[35]。GAPDH酶是有氧糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，其功能具有多效性，GAPDH的非糖酵解功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、細(xì)胞自噬及DNA修復(fù)等，被認(rèn)為是癌癥和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的潛在治療靶點(diǎn)[36]。

本研究進(jìn)一步進(jìn)行了功能富集分析，以尋找與這些差異基因相關(guān)的蛋白功能。在GO分析中，細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)錄的正負(fù)調(diào)控被富集。細(xì)胞的異常增殖與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，表明有相關(guān)癌基因的過(guò)度表達(dá)或抑癌基因的表達(dá)降低。此外，PI3K-Akt、蛋白聚糖及黏著斑信號(hào)通路被富集。PI3K-Akt信號(hào)通路參與多細(xì)胞過(guò)程，其過(guò)度激活與腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫微環(huán)境及癌細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)[37]。富含亮氨酸的小蛋白聚糖(SLRP)是細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。蛋白聚糖是一類調(diào)節(jié)膠原纖維形成的SLRP，也是一種天然的泛酪氨酸激酶抑制劑，可以減少腫瘤的生長(zhǎng)[38]。經(jīng)多種體內(nèi)外的腫瘤模型研究發(fā)現(xiàn)，蛋白聚糖具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、血管生成及腫瘤遷移的功能，是對(duì)抗實(shí)體腫瘤的理想候選藥物[39]。黏著斑是大的、含整合素的多蛋白跨膜組裝物，將細(xì)胞骨架與周圍的細(xì)胞外基質(zhì)相連，在細(xì)胞黏附和信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，是上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、組織損傷反應(yīng)和腫瘤發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子[40]。

圖5 腫瘤組織和正常組織在人體圖中的中位表達(dá)，A.CDC20，B.AURKB，C.CCNB1，D.AKT1，E.GAPDH

圖6 CDC20、AURKB、CCNB1、AKT1、GAPDH基因表達(dá)水平與漿液性卵巢癌患者的預(yù)后關(guān)系

綜上所述，通過(guò)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選基因數(shù)據(jù)集并鑒定出漿液性卵巢癌和正常組織的DEGs。采用GO功能和KEGG通路富集分析進(jìn)一步表明了DEGs在漿液性卵巢癌的作用。此外，研究表明CDC20、AURKB、CCNB1、AKT1及GAPDH基因可能與患者的預(yù)后差有關(guān)。本研究為進(jìn)一步研究漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展、篩選預(yù)后標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)提供了一定的研究基礎(chǔ)。