減肥膠囊對3T3-L1細胞增殖與分化的影響研究

金小琴，趙璐，孟長海

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州；2.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州)

0 引言

肥胖是一種慢性代謝紊亂性疾病，一般認為是由于能量攝入和消耗失衡引起，且與遺傳和環境因素相關[1]。隨著社會的進步、人民生活水平的提高，肥胖的發病率逐年上升。肥胖不僅與2型糖尿病、高血壓、心血管疾病及其他代謝性疾病有關，還參與腫瘤的生長、侵襲和轉移等過程，是多種腫瘤預后不良因素[2]。另有研究表明肥胖與低程度的炎癥、認知功能障礙、術后感染以及內皮功能障礙等相關[3-4]。肥胖已經成為嚴重影響人民生活質量的慢性疾病之一。世界衛生組織調查發現，2014年世界上已有超過19億成年人(39%成年人)超重，有多于6億的成年人(13%成年人)肥胖。2015年，中國居民營養與慢性病調查報告中顯示，18歲及以上成人超重率為30.1%，肥胖率為11.9%[5]。大多數肥胖的治療方法都著眼于減少能量攝入和體育鍛煉。此外，另外一種替代治療方法，即提高細胞的能量代謝，開始逐漸被人們所關注。然而，當前的證據表明，減輕體重的治療措施由于治療后會出現體重的快速回升，其治療效果有著很大的限制。迄今為止，治療肥胖的有效藥物都伴有一些嚴重的副作用[6]。因此，尋找積極、有效、安全的治療方法，具有最重要的理論依據和現實意義。

肥胖的根本原因是能量攝入和能量消耗之間不平衡，導致過度或異常的脂肪堆積。早期研究認為成體內脂肪細胞數量是恒定的，體積增大是脂肪細胞在肥胖時的主要病理變化[7]。近年來，脂肪細胞在成年人體內更替狀況的研究表明，成人脂肪細胞存在每年約10%的更新[8]，這提示成人脂肪組織中也存在前體細胞向成熟脂肪細胞的分化。脂肪的體積與脂肪細胞的數量和體積有關，脂肪細胞數量由前脂肪細胞的數量決定，同時還取決于前脂肪細胞向脂肪細胞分化的速率，脂肪細胞的體積取決于前脂肪細胞向脂肪細胞分化的程度。因此，抑制前脂肪細胞的增殖與分化可以減少脂肪組織質量，減少肥胖的發生[9]。

減肥膠囊是導師根據多年臨床經驗總結所得的有效方劑，前期研究證實減肥膠囊可降低患者體重指數(BMI)、腰臀圍、空腹瘦素和胰島素水平，結合飲食、運動治療單純性肥胖癥(胃熱濕阻證)效果良好[10]。減肥膠囊可通過對肥胖大鼠脂肪組織瘦素受體后JAK-STAT信號轉錄系統的影響來發揮減肥作用[11]。本研究將從分子層面進一步研究減肥膠囊通過抑制前脂肪細胞的增殖與分化的減肥機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞

3T3-L1細胞，購自上海中科院細胞庫。

1.1.2 實驗用藥

生大黃10g、生何首烏12g、黃芩15g、澤瀉15g、荷葉15g、生山楂15g，購于河南中醫學院第一附屬醫院。將以上六味藥制成水煎溶液，含生藥1mg/mL。

1.2 所需主要試劑(盒)、耗材和儀器

1.2.1 所需試劑

DMEM培養基；無支原體胎牛血清(FBS)；胰島素(Insulin)；地塞米松(Dexamethasone,D.x.m)；3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(IBMX)；四甲基偶氮噻唑藍(MTT)；PBS磷酸鹽緩沖液；異丙醇；油紅0染色劑；多聚甲醛；臺盼藍；二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)；胰蛋白酶；甲醛等。

1.2.2 所需耗材及儀器

電子計重稱；低溫高速離心機；電熱恒溫水浴鍋；恒溫CO2培養箱；生物潔凈工作臺。

倒置顯微鏡；低速臺式大容量離心機；架盤藥物天平；冰箱；液氮罐；75%醫用酒精；96孔細胞培養板；25cm2細胞培養瓶；2.0mL細胞凍存管；孔徑0.22um 25mm2一次性濾器；10ul、100ul、1000ul移液器；臺式水浴恒溫振蕩器(TSHZ-A)；EH型高壓消毒鍋；恒溫烤箱；酶標儀等。

1.3 實驗方法

1.3.1 減肥膠囊水溶性提取物的制備

將生大黃10g、黃芩12g、何首烏15g、澤瀉15g、山楂15g、荷葉15g在800mL純水中浸泡30min，藥物在砂鍋中煮沸30min,濾布過濾，再用800mL純水煮沸30min，濾布過濾將兩次藥物溶液混合后4000n/min離心15min，取上清，棄沉淀；將藥物水溶性提取物沸騰濃縮后放入蒸發皿中置于水浴鍋上進一步濃縮成膏狀，將蒸發皿置于小型真空干燥箱中干燥成干膏，計算出藥物的出膏率，用粉粹機粉碎成粉末狀，放入真空袋中備用。

1.3.2 減肥膠囊對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響

光鏡下觀察細胞分化進程減慢，進行油紅“O”染色，觀察形成脂肪顆粒的多少等。

1.3.3 減肥膠囊對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

3T3-L1前脂肪細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，當細胞融合后2天時，培養基換成誘導液1(DMEM+10%胎牛血清+0.5mmol/L M3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+1umol/L地塞米松+10mg/L重組人胰島素)，48h后換成將培養基換成誘導液2(DMEM+10%胎牛 血清+10mg/L重組人胰島素)，48h后將培養基再換成含10%胎牛血清的DMEM培養基中，再培養四天。將細胞用PBS洗3次，用含10%福爾馬林在室溫下固定1h,用PBS洗3次，之后用油紅O染色1h,即可在鏡下觀查細胞形態，拍照。用PBS洗3次，洗掉多余的油紅O，用100%異丙醇萃取20min,在分光光度計490nm波長比色，記錄A值。比較A值的差異反映藥物對細胞分化的影響。分化程度與油滴大小、吸光度成正相關。根據公式計算抑制率。抑制率/%=(A對照組一A實驗組)/A對照組×100%。

注：每次換液的同時加入0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL的藥物，設3孔重復，同時設調零孔(不加細胞、藥物)、對照孔(不加藥物)，板的周邊用用PBS緩沖液填充。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 減肥膠囊水溶性提取物對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響

用含不同濃度藥物的培養基作用于3T3-L1前脂肪細胞，分別在培養24h、48h、72h后用MTT比色法測定細胞增殖情況。顯微鏡下觀察細胞，對照組細胞增殖旺盛， 0.1μg/mL藥物組細胞增殖與對照組無明顯差異，1μg/mL 藥物組與對照組差異不明顯，10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL藥物組細胞增殖緩慢，部分細胞在2天后出現大部分凋亡。統計學分析，所有數據用(±s)表示，如表1。

表1 不同濃度藥物對細胞增殖的影響

表1 不同濃度藥物對細胞增殖的影響

注：與對照組比較，☆表示P＜0.05，★表示P＜0.01

組別 例數(n)劑量(ug/mL) 24h 48h 72h 1 3 0.1 0.94±0.07 1.55±0.13☆ 2.05±0.01★2 3 1 0.85±0.01★ 1.34±0.07★ 1.75±0.01★3 3 10 0.49±0.06★ 0.80±0.07★ 0.80±0.01★4 3 100 0.32±0.03★ 0.43±0.07★ 0.32±0.00★5 3 1000 0.16±0.06★ 0.21±0.10★ 0.21±0.01★6 3 0 0.95±0.06★ 1.58±0.02★ 2.31±0.01★

(1)藥物作用24h后，0.1μg/mL藥物組與對照組比較無統計學意義(P＞0.05)，與其他藥物組比較均有顯著統計學意義(P＜0.01)；其他藥物組之間比較、與對照組比較均有顯著統計學意義(P＜0.01)；(2)藥物作用48h后，0.1μg/mL藥物組與對照組比較有統計學意義(P＜0.05)，與其他藥物組比較有顯著統計學意義(P＜0.01)，其他藥物組與各組比較均有顯著統計學意義(P＜0.01)；(3)藥物作用72h后，各藥物組與對照組比較均有顯著統計學意義(P＜0.01)，各藥物組之間比較也有顯著統計學意義(P＜0.01)。

使用不同濃度藥物處理后，隨著時間和劑量的增加，藥物對細胞增殖的抑制率升高，成有一定的時間-劑量依賴關系。如圖2所示：

圖2 藥物對細胞增殖的抑制作用示意圖

圖3 藥物作用前后細胞增殖圖

2.2 減肥膠囊水溶性提取物對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

3T3-L1前脂肪細胞在誘導分化的第2天細胞體積開始變大，分化的第3天開始，細胞內可見散在的脂質小顆粒，隨后脂肪顆粒開始增多、增大，細胞形態有原來的梭形變為橢圓形或圓形，到分化第8天，大部分細胞分化成熟，小脂肪滴融合為較大脂肪滴。

油紅0是脂肪特異性染色劑，能與脂肪結合，使脂肪細胞中的脂滴著色，因此常用來染色分化成熟的脂肪細胞，以觀察脂肪細胞中脂肪的含量。光鏡下，3T3-L1前脂肪細胞形態與成纖維細胞相似，呈長梭型，細胞內沒有脂肪積聚，油紅O染色后細胞不著色。誘導分化后，細胞形態變圓，胞漿出現脂滴，隨著分化程度的加深，脂滴積聚增多。

表2 不同濃度藥物對細胞分化的影響

表2 不同濃度藥物對細胞分化的影響

注：與對照組比較，☆表示P＞0.05，★表示P＜0.01

組別 1 2 3 4 5 6例數 3 3 3 3 3 3劑量(ug/mL) 0.1 1 10 100 1000 0±s 1.11±0.00☆ 0.94±0.00★ 0.80±0.01★ 0.50±0.01★ 0.10±0.00★ 1.12±0.00★

在顯微鏡下觀察細胞分化，其中0.1μg/mL藥物組對細胞分化影響與對照組比較不明顯，1μg/mL、10μg/mL、 100μg/mL藥物組與對照組比較細胞分化進程減慢，形成脂肪顆粒比對照組減少，1000μg/mL藥物組脂肪細胞形態有所變但無脂肪顆粒分泌。所有數據用(±s)表示，如表2所示。

根據結果分析，1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL 藥物組對3T3-L1前脂肪細胞分化有顯著影響，抑制率較高，有顯著統計學意義(P＜0.01)；0.1μg/mL藥物組對3T3-L1前脂肪細胞分化無明顯影響，抑制率較低，結果無統計學意義(P＞0.05)。

圖4 不同濃度藥物組對細胞分化影響示意圖

圖5 不同濃度藥物對細胞分化抑制率示意圖

圖6 藥物作用前后細胞分化示意圖

3 減肥膠囊作用機理的探討

減肥膠囊是宰軍華導師根據祖國醫學理論并結合臨床觀察、實驗研究等，組成的經驗用方，主要用于胃熱濕阻是單純營養性肥胖病治療。其藥物組成有生大黃、山楂、荷葉、澤瀉、何首烏、黃芩等。方中生大黃清熱瀉下，活血化瘀，為君藥；何首烏補肝腎益精血，潤腸通便，使痰濕膏脂易于排出體外；黃荃清熱燥濕、瀉火解毒；澤瀉滲濕清熱，祛痰濕膏脂，三者共為臣，助大黃清熱化濕，潤腸通便，祛痰化濁。荷葉疏肝健脾、除濕化痰、調脂減肥；山楂健脾開胃、促進消化，既善消油膩肉食積滯、又能行氣散疲，二藥共為佐，祛痰癖、除脂膏。諸藥共用，清胃瀉熱、去痰濁、化瘀血。以往通過減肥膠囊對肥胖大鼠脂肪組織瘦素受體后JAK-STAT信號轉錄系統的影響的研究表明：不同濃度的減肥膠囊水煎液能夠提升肥胖大鼠下丘腦和脂肪組織中JAK1，STAT3，STAT6基因表達水平，減肥膠囊的作用機制可能是通過對下丘腦和脂肪組織中瘦素受體后信號轉錄系統的影響而發揮作用[12]。減肥膠囊減肥作用明顯，能夠有效的控制肥胖大鼠的體重增長，降低肥胖大鼠脂肪細胞的體積和平均濕重[13]。經過前期動物實驗發現，本方顆粒制劑能明顯延緩肥胖大鼠體重增長速度，降低脂肪系數，減輕體重和脂肪含量，增強下丘腦OB基因及UCP2基因表達，抑制NPY基因表達，降低血漿神經肽Y含量；并可減輕“瘦素抵抗”，調節瘦素基因表達水平，從而增強靶器官對瘦素的敏感性[14]。而相關臨床研究也證實，服用減肥膠囊后，患者的BMI、腰臀圍降低的同時，其瘦素、胰島素水平較治療前亦有明顯下降，還有明顯的降脂、降糖作用，顯著優于單純飲食運動療法[15]。

總之，本方緊扣臨床實際和肥胖病的發病特點，合用諸藥，共奏清胃瀉熱，通腑利濕之功效而達到治療目的。減肥膠囊對3T3-L1前脂肪細胞增殖、分化的實驗研究證明減肥膠囊能夠抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖，使細胞增殖速度減慢；能夠抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化，能使細胞分化速度減慢，使脂肪細胞分泌脂肪顆粒減少。減肥膠囊的作用機制是多方面的，可能與影響信號轉導通路、脂肪細胞分泌功能等有密切的關系。但是否是特異性對應關系，需要進一步研究；其抑制前脂肪細胞增殖與分化的機制需要進一步探討。