UPLC建立芍藥甘草湯指紋圖譜及測定多種水溶性活性成分的含量△

呂欣鍇，路娟，鄭巧，柴瑞平，俞月，鄧明慧，李海濤，陳曦*

1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100

芍藥甘草湯是由白芍、甘草配伍而成的中藥復方湯劑，其應用歷史悠久，療效顯著，早在漢代張仲景所著《傷寒論·辨太陽病脈證并治》中便有記載[1]。方中白芍苦、酸，微寒，養(yǎng)血斂陰、滋養(yǎng)筋脈；甘草甘，平，善入太陰、補脾益氣，兩者相伍，酸甘化陰，制勝脾胃[2]，共奏調(diào)和肝脾、緩急止痛之功效。現(xiàn)代藥理研究表明，芍藥甘草湯具有抗炎鎮(zhèn)痛[3-4]、保肝利膽等功效，臨床常用于多種痛癥及炎癥性疾病的治療[5]。

2018年4月，芍藥甘草湯成為《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》所載方劑[6]，使芍藥甘草湯成為近兩年的研究熱門。目前已有學者建立了芍藥甘草湯的HPLC檢測方法及方中藥材、飲片的部分物質(zhì)基準[7]，但此法耗時較長；還有學者建立了超高效液相色譜法(UPLC)檢測方法，但對多批次藥材的質(zhì)控并未進一步檢測與分析[8]。本文建立了同時檢測多批次芍藥甘草湯水煎液中7種活性成分的UPLC方法。基于實驗室前期對芍藥甘草湯指紋圖譜的考察，進一步完善方法，旨在對其整體化學成分研究及藥效物質(zhì)基準進一步發(fā)掘，為芍藥甘草湯的新劑型開發(fā)及臨床應用提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters UPLC H-Class 系統(tǒng)；AB265-S 分析天平(瑞士METTLER公司)；JA11002 電子天平(上海菁海儀器有限公司)；2-16R 臺式高速微量冷凍離心機(上海托莫斯科學儀器有限公司)；奇俞牌智能煎藥壺(2.5 L)(深圳市時光主語實業(yè)發(fā)展有限公司)；各種規(guī)格移液槍(Eppendorf公司)。

1.2 試藥

白芍和甘草飲片經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所云南分所李海濤教授鑒定均為正品，且符合 2015年版《中華人民共和國藥典》標準。根據(jù)藥材批號，將飲片隨機組合用于制備 11 批次芍藥甘草湯樣品，飲片具體信息見表1。

表1 白芍及甘草飲片信息

甲醇、乙腈(Merck公司)；磷酸(西隴化工股份有限公司)；對照品甘草苷(批號：180305)、異甘草苷(批號：180427)、異甘草素(批號：180321)、芹糖基異甘草苷(批號：170706)、甘草酸銨(批號：180402)、芍藥苷(批號：180302)、芍藥內(nèi)酯苷對照品(批號：180216)均購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度>98%；實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法及結果

2.1 色譜條件

Waters Xselect Hss T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)；梯度洗脫(0～5 min，10%～11.3%A；5～30 min，11.3%～100%A)；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃；二極管陣列檢測器(PDA)定時波長處理：0～18 min，230 nm，18.01～30 min，250 nm；進樣量：2 μL。

2.2 供試品溶液的制備

《傷寒論》中記載芍藥甘草湯的用法用量：白芍藥、炙甘草各四兩。上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服[9]。按照漢代一兩等于15.5 g，一升等于200 mL，一合等于20 mL計算。稱取甘草、白芍各62 g，加水600 mL，浸泡30 min，用煎藥壺先武火20 min，再文火40 min進行煎煮至300 mL。經(jīng)紗布(8層)過濾后，取適量濾液，10 000 r·min-1(離心半徑為 6 cm)，4 ℃，離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，濾液用甲醇稀釋5倍，即得。其余樣品-20 ℃冷凍儲存。根據(jù)此法，由不同產(chǎn)地批次飲片制得的11批次芍藥甘草湯，具體見表2。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草酸銨、芹糖基異甘草苷、異甘草素、異甘草苷、甘草苷對照品5 mg，用純甲醇定容，制得7個質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品儲備液。精密吸取0.5 mL芍藥內(nèi)酯苷儲備液、2 mL芍藥苷儲備液、1 mL甘草酸銨儲備液、0.2 mL芹糖基異甘草苷儲備液、0.2 mL異甘草素儲備液、0.3 mL異甘草苷儲備液、0.8 mL甘草苷儲備液于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制得混合對照品溶液。分別精密吸取適量混合對照品儲備液，用甲醇定容配制成不同濃度的對照品溶液。4 ℃存放備用，測定前使用0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.4 方法學考察

2.4.1精密度試驗 精密吸取芍藥甘草湯對照品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算RSD。結果測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、異甘草素、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.68%、2.18%、2.09%、2.64%、2.15%、1.21%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.4.2重復性試驗 取S1批次供試品溶液，按2.1項下測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算RSD。結果測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、異甘草素、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.77%、0.94%、0.60%、2.68%、0.85%、0.72%、0.55%，表明本方法重復性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗 取S1批次供試品溶液，分別于第0、2、4、6、8、12 h，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算RSD。結果測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、異甘草素、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.25%、1.36%、1.20%、8.39%、11.33%、14.51%、0.60%，表明供試品溶液中各成分在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4專屬性考察 按照2.2項下記錄的供試品溶液制備方法分別制備甘草和芍藥的單味樣品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。

注：A.空白溶劑；B.混合對照品；C.單味甘草水煎液；D.單味白芍水煎液；E.S1批次全方；F.S1批次全方局部放大圖；1.芍藥內(nèi)酯苷；2.芍藥苷；3.甘草苷；4.芹糖基異甘草苷；5.異甘草苷；6.異甘草素；7.甘草酸銨。圖1 PDA定時波長處理后芍藥苷湯樣品及混合對照品色譜圖

2.4.5加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的S1批次供試品溶液3份，分別加入已知含量的混合對照品溶液，使得到的混合對照品中化學成分濃度為已知樣品中化學成分濃度的80%、100%、120%。用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液。然后按照2.1項下色譜條件每個混合對照品溶液重復進樣3次，計算回收率和RSD。結果芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、異甘草素、甘草酸銨平均回收率分別為93.77%、94.16%、105.62%、103.81%、92.57%、90.87%、91.25%，RSD分別為1.21%、0.07%、0.81%、4.06%、2.72%、0.81%、0.81%，表明本方法準確可靠，此法加樣回收率良好。

2.5 11批次芍藥甘草湯指紋圖譜的建立及相似度評價

2.5.1指紋圖譜的建立 將11批次處理好的芍藥甘草湯UPLC圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2004 A版進行色譜峰匹配，得到指紋圖譜，經(jīng)處理后共標定59個共有峰，其中43號色譜峰分離度較好，峰面積較大且穩(wěn)定，保留時間合適，故確定43號色譜峰為參照峰。并指認出7個共有峰，分別為芍藥內(nèi)酯苷(14號峰)、芍藥苷(15號峰)、甘草苷(17號峰)、芹糖基異甘草苷(28號峰)、異甘草苷(29號峰)、異甘草素(39號峰)、甘草酸銨(41號峰)，11批次芍藥甘草湯UPLC指紋圖譜見圖2。

圖2 11批次芍藥甘草湯UPLC指紋圖譜

2.5.2相似性評價結果 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2004 A版軟件計算分析，得到11批芍藥甘草湯供試品色譜圖的相似度，具體數(shù)據(jù)見表3。根據(jù)結果，11批次相似度>0.98，表明此11批次間差異較小，甘草3個產(chǎn)地5個批次及白芍2個產(chǎn)地4個批次的飲片質(zhì)量較為均一。

2.6 11批次芍藥甘草湯中7種水溶性成分線性關系考察及含量測定

為進一步對不同產(chǎn)地批次藥材進行分析，我們對11批次芍藥甘草湯中已指認的7種成分進行了含量測定。首先以對照品的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，建立各成分標準曲線，得到回歸方程和r，結果見表4。根據(jù)標準曲線，計算各批次芍藥甘草湯中7種水溶性成分的含量，結果見表5。結果表明，各產(chǎn)地各批次藥材的各成分含量存在差異，但總體而言差異較小，此結果與相似度評價結果趨于一致。

3 討論

芍藥甘草湯是由芍藥、甘草配伍所得，兩者協(xié)同共奏調(diào)和肝脾、柔筋止痛之功效，其化學成分復雜多樣，研究表明[11]，芍藥甘草湯的原方入血成分多達17種，因此對原方中化學成分的整體研究顯得尤為重要。將芍藥、甘草中較為穩(wěn)定且分離良好的7種成分作為本實驗考察重點，其中5種成分來自甘草，2種成分來自芍藥，包括了芍藥苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸等重要藥效物質(zhì)基礎[12]。

表3 11批芍藥甘草湯供試品色譜圖中色譜圖相似度

表4 芍藥甘草湯各成分標準曲線及線性范圍

注：甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7[10]。

實驗最初選擇乙腈(A)-醋酸-醋酸銨緩沖溶液(pH=4.5)(B)作為流動相，采用梯度洗脫28 min的方法，發(fā)現(xiàn)此法波動較大，對部分成分的分離度不佳，影響其含量測定；隨后將流動相B改為0.1%的磷酸水溶液，并將梯度洗脫延長至40 min，較前者，此法較為穩(wěn)定，且分離度均較佳，但前20 min出峰較少，運行時間較長，效率較低；最后調(diào)整梯度洗脫程序，將方法穩(wěn)定在30 min。此法穩(wěn)定性較佳，峰形較好且簡單易行，適用于芍藥甘草湯的初步定性定量分析。

本實驗的芍藥甘草湯是根據(jù)古代經(jīng)典名方開發(fā)要求進行制備，其水煎液濃度較高，成分復雜，且不同成分的最大紫外吸收存在差異。根據(jù)實驗及查閱文獻發(fā)現(xiàn)，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、甘草苷這5種成分在230 nm附近響應較高[13-14]，甘草酸銨和異甘草素的最大吸收波長于250 nm左右[15]，而單一在230 nm或250 nm下部分峰響應較低，因此很難在單一波長下對其整體化學成分進行表征。故最終選擇二極管陣列檢測器(PDA)定時波長：0～18 min，230 nm；18.01～30 min，250 nm。此波長下基線平穩(wěn)，峰響應值較高。

本文建立了同時檢測芍藥甘草湯中7種水溶性成分的超高效液相色譜法(UPLC)，通過建立了指紋圖譜、相似度評價分析，發(fā)現(xiàn)由甘草3個產(chǎn)地5個批次、白芍2個產(chǎn)地4個批次飲片制得的11批芍藥甘草湯的相似度均大于0.98，表明該11批次芍藥甘草湯樣品間差異較小，制備工藝較為穩(wěn)定。隨后對 11批次樣品進行含量測定，發(fā)現(xiàn)2個產(chǎn)地共4批次白芍、3個產(chǎn)地5批次甘草中各成分含量差異較小，RSD<15%，此結果與相似度評價結果趨于一致。綜上所述，本研究從定性、定量的角度，對經(jīng)典名方——芍藥甘草湯的物質(zhì)基準進行了初步研究，建立了芍藥甘草湯穩(wěn)定、簡便的UPLC測定方法，為其進一步基礎研究、新劑型發(fā)展及臨床應用提供參考。

表5 11批次芍藥甘草湯中7種成分含量 μg·mL-1