通絡駐景丸對糖尿病大鼠血-視網膜屏障保護作用的機制研究

雷曉琴，周云云，李雨薇，宋虎平，任翠翠

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最為常見和嚴重的微血管并發癥之一，是成人致盲的最常見的病因之一[1]。DR 早期以視網膜血管瘤、出血、滲出為主；晚期出現新生血管、增生性病變、視網膜脫離，嚴重影響患者生活和工作[2]。近年研究表明，血-視網膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的破壞是該病變的主要病理學基礎。在DR 病變過程中，由于BRB 的破壞，引起視網膜出血、滲出，導致視網膜病變的發生發展[3]。緊密連接（tight junction,TJ） 是BRB 的重要組成部分之一，TJ 的分子結構包含多種跨膜蛋白，研究較多的有咬合蛋白Occludin和帶狀閉合蛋白ZO-1。這些蛋白的表達量、位置、結構變化及表達功能的降低或增加等，最終都會影響TJ 的粘接性能，并最終影響BRB 的功能。因此，可以通過研究視網膜的白蛋白（Albumin）滲漏、咬合蛋白（Occludin）、帶狀閉合蛋白ZO-1 的表達水平以及Occludin mRNA 含量來反映BRB 的功能。

通絡駐景丸是在中醫藥理論的指導下，結合長期的臨床經驗形成的治療DR 肝腎陰虛兼有血瘀證的協定方[4-5]。本實驗在前期臨床和動物實驗研究基礎上[6-7]，用鏈脲佐菌素（STZ）建立動物模型，并設計使用一組含有梯度濃度通絡駐景丸藥液進行干預，通過檢測視網膜的Albumin 滲漏，視網膜組織中Occludin、帶狀閉合蛋白ZO-1 的表達水平以及Occludin mRNA 含量，揭示通絡駐景丸對血-視網膜屏障的保護作用，為其治療DR 提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量180～220 g，購于西安交通大學醫學部實驗動物中心，許可證號：SCXK（陜）2017-003。

1.2 主要實驗試劑與儀器

STZ（Sigma 公司，美國）；5×SDS 蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（西安赫特生物科技有限公司）；PVDF 膜（Millipore 公司）；總RNA 提取試劑盒、Prime Script RT Master Mix (Perfect Real Time) 試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II (TliRNase H Plus)試劑盒（Takara 公司）；羅氏血糖儀和卓越金銳血糖試紙（羅氏診斷有限公司，德國）。高速冷凍離心機HC-3018R（科大創新股份有限公司）；倒置相差顯微鏡BX53（Olympus 公司，日本）；生物顯微成像系統DP72 （Olympus 公司，日本）；超低溫冰箱SANYO（SANYO 公司，日本）；電泳儀JY300C（北京君意東方電泳設備有限公司）。

通絡駐景丸（組成：熟地黃、菟絲子、車前子、三七、蒲黃、砂仁、地龍等）以湯劑形式在臨床上應用，故在前期工作中就對其水提取工藝采用正交試驗的方法確定了最佳工藝條件為： 以上藥材除砂仁外的其余7 味藥材加10 倍量水，煎煮40 min，后下砂仁，再煎煮10 min，濾取藥液。藥渣再加8 倍量水，煎煮30 min，濾取藥液。合并兩次煎液，即得。為給藥方便，將藥液濃縮為100 mL（即生藥量0.78 g/mL）。動物實驗時，根據動物與人體表面積換算法分高、中、低劑量組給藥。

1.3 造模和分組

健康雄性SD 大鼠75 只，適應性飼養1 周，采用隨機數表法將大鼠分為5 組：空白組（NC 組），模型組（DM 組），通絡駐景丸低、中、高劑量組（TLP-L組、TLP-M 組、TLP-H 組），每組15 只。按1%濃度將STZ 溶解于新鮮配制的檸檬酸緩沖液中，60 mg/Kg體質量腹腔注射誘發糖尿病。NC 組按60 mg/Kg 體質量腹腔注射檸檬酸緩沖液，其余大鼠腹腔注射STZ 造模。整個過程無菌操作，10 min 內完成。注射后30 min 恢復進食。72 h 后大鼠尾靜脈采血測量血糖，剔除隨機血糖低于16.7 mmol/L 的大鼠。DM 組和NC 組大鼠給予蒸餾水，TLP-L、TLP-M 和TLP-H組分別按照通絡駐景丸1.65、3.33、6.66 g 生藥/Kg灌胃給藥，給藥容積2 mL/100 g 體質量。每日灌胃1次，連續12 周。

給藥結束后用烏拉坦麻醉大鼠，立即摘取眼球，將眼球置于顯微鏡下，從角鞏膜緣處切開眼球，取出晶狀體和玻璃體，視網膜與脈絡膜及鞏膜組織出現分離，顯微剪輕柔進入視網膜下，從視乳頭部向前輕輕擠壓，將完整的灰白色視網膜組織分離。將分離出的視網膜組織裝入EP 管，并進行低溫保存（-80℃），用于后續實驗。

1.4 視網膜組織Albumin 滲漏檢測

充分暴露大鼠心臟，用生理鹽水行心臟灌注術除去體循環內的血液，然后摘取大鼠眼球用于視網膜組織中Albumin 滲漏檢測。

1.5 Western blot檢測視網膜組織Albumin、Occludin、ZO-1 的蛋白表達水平

裝有視網膜的EP 管中加入組織蛋白裂解液，玻璃勻漿器對視網膜組織手動勻漿30 s，靜置30 min，全程冰上操作。充分裂解后轉移至另一預冷離心管中，12000 rpm，4℃離心15 min，取上清液即為總蛋白。按照BCA 蛋白試劑盒的說明，繪制BCA 標準曲線，測定蛋白濃度。配置分離膠和濃縮膠，取蛋白樣品作SDS-PAGE 電泳，上樣，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育過夜，TBST 洗滌，二抗孵育2 h，TBST 洗滌，顯影，保存條帶。用Image-Pro Plus 對以上獲得的蛋白條帶進行OD 值測定，完成蛋白表達量的定量分析。計算方法為：蛋白表達量=×100%。

1.6 視網膜Occludin mRNA 表達的測定

采用實時定量熒光PCR 法測定大鼠視網膜組織內Occludin mRNA 表達的影響。Trizols 試劑提取視網膜總RNA，取RNA 樣品用1×TE 緩沖液稀釋樣品適當倍數，用核酸濃度測量儀測濃度和純度。取RNA2μg 進行反轉錄，生成的產物cDNA 保存于-20℃備用。Real-time PCR 應用Thermal Cycler Dice Real Time System 擴增儀，檢測目的基因的相對表達采用SYBR Green I 染料兩步法，反應條件的優化是用所有cDNA 產物等體積的混合樣試驗。反應條件如下：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共40 個循環。Occludin mRNA 表達以β-actin 為內標來測算。使用Primer5.0 軟件設計引物，引物序列見表1。相對表達量2－△△Ct 計算公式如下：△△Ct=（Ct目的基因-Ct內參基因）模型組-（Ct目的基因-Ct內參基因）正常組。

1.7 統計學方法

用SPSS 17.0 統計軟件分析，各組數據均為計量資料，用均值±標準差（）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）方法，組內兩兩比較應用LSD-t檢驗。若P＜0.05，則認為差異有統計學意義。

表1 相關目的基因和內標基因的引物序列

2 結果

2.1 視網膜組織中Albumin 的滲漏

5 組間Albumin 的蛋白含量比較，F=241.518，P=0.000，有統計學意義。兩兩比較，DM 組Albumin的蛋白含量明顯高于NC 組（t=26.956，P=0.000），有統計學意義。與DM 組相比，TLP-L、TLP-M 和TLP-H組Albumin 蛋白含量有顯著降低，均有統計學意義（tTLP-H=21.596，tTLP-M=10.210，tTLP-L=6.861，均P=0.000）（圖1，表2）。

2.2 視網膜組織Occludin、ZO-1 的蛋白表達水平

Occludin 蛋白表達：5 組間比較，F=255.438，P=0.000，有統計學意義。兩兩比較，DM 組與NC 組相比，視網膜組織中Occludin 的蛋白含量降低（t=27.795，P=0.000），有統計學意義。TLP-H 和TLP-M 組與DM組相比，Occludin 的蛋白含量均有不同程度升高（tTLP-H=14.216，tTLP-M=6.679，均P=0.000），均有統計學意義。而TLP-L 組與DM 組比較，t=1.907，P=0.086，無統計學意義。

ZO-1 的蛋白表達：5 組間比較，F=130.453，P=0.000，有統計學意義。兩兩比較，DM 組與NC 組相比，視網膜組織中ZO-1 的蛋白含量降低，t=19.386，P=0.000，有統計學意義。TLP-H 和TLP-M 組與DM組比較，均有統計學意義（tTLP-H=11.498，tTLP-M=5.694，均P=0.000）。而TLP-L 組與DM 組比較，t=0.857，P=0.412，無統計學意義（圖1，表2）。

2.3 視網膜中咬合蛋白Occludin mRNA 表達

圖1 Albumin、Occludin 和ZO-1 的蛋白表達情況

表2 各組大鼠視網膜中Albumin、Occuldin 和ZO-1 蛋白表達量(,n=3)

表2 各組大鼠視網膜中Albumin、Occuldin 和ZO-1 蛋白表達量(,n=3)

注：* 與正常對照組比較，P＜0.05。# 與模型組比較，P＜0.05。TLP-L：通絡駐景丸低劑量組；TLP-M：通絡駐景丸中劑量組；TLP-H：通絡駐景丸高劑量組；Albumin：白蛋白；Occludin：咬合蛋白；ZO-1：帶狀閉合蛋白-1；β-actin：β-肌動蛋白

5 組間比較，F=15.013，P=0.000，有統計學意義。兩兩比較，與DM 組相比，通絡駐景丸給藥組Occludin mRNA 含量均有不同程度升高，TLP-H 組和TLP-M 組中Occludin mRNA 的含量有顯著升高，差異有統計學意義 （tTLP-H=4.845，PTLP-H=0.001；tTLP-M=3.835，PTLP-M=0.003），而TLP-L 組與DM 組比較，t=1.615，P=0.137，無統計學意義（圖2）。

圖2 視網膜Occludin mRNA 表達情況

3 討論

目前，DR 的發病機理尚不十分清楚，但BRB 的破壞是DR 標志之一，是引起黃斑水腫進而造成糖尿病患者失明的最常見原因[8]。血-視網膜屏障（BRB）像血腦屏障一樣，可以阻擋血管內血液成分、大分子物質和毒性物質滲漏到視網膜，以維持光學介質的透明性，維持最佳的視網膜水合作用和視網膜厚度，維持視網膜微環境的動態平衡。因此，完整的BRB是維持視網膜正常的結構和功能所必需的。BRB 分為內屏障（iBRB）和外屏障（oBRB）。iBRB 和oBRB的重要組成部分之一是緊密連接（TJ），BRB 的通透性與TJ 的結構狀態密切相關。正常情況下視網膜內屏障可阻止血管內液體和大分子物質滲漏到視網膜，外屏障則阻止脈絡膜毛細血管血液滲漏到視網膜[9]。各種原因，如缺血、糖代謝異常、炎性細胞因子的釋放、玻璃體以及視網膜前膜的機械牽引等都可以對血-視網膜屏障造成破壞，導致血管內液體及大分子物質滲漏到細胞外間隙，形成視網膜水腫，后期引起異常的血管生成、出血，最終導致視力損害或失明。

Albumin 是血漿中含量最多的蛋白質，占血漿總蛋白的40%～60%，細胞外液中僅有極微量的存在。正常的血-視網膜屏障可阻止視網膜血管中Albumin 滲漏到細胞間隙中，心臟灌注后可清洗掉血管內未粘附的Albumin，檢測視網膜剩余Albumin的含量，可作為評估視網膜滲漏的一種方式[10]。在本實驗中，糖尿病模型組大鼠的視網膜的Albumin 滲漏量明顯高于空白對照組，而通絡駐景丸高劑量組滲漏量顯著低于模型組，展示出高劑量的通絡駐景丸對于糖尿病大鼠血-視網膜屏障的保護作用。

TJ 是內、外屏障的結構和功能的基礎，對維持上皮細胞間的極性，控制水、大分子、細胞及其他分子進行選擇性細胞旁通透，維護機體內環境的穩定性和維持BRB 的完整性起決定性的作用。TJ 由多種蛋白構成，其分子結構包括多種跨膜蛋白（包括咬合蛋白Occludin、閉合蛋白Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3）和緊密連接周邊蛋白（包括帶狀閉合蛋白ZO-1，ZO-2,ZO-3、扣帶蛋白等） 和連接黏附分子JAM 等。這些蛋白的表達量、位置、結構變化及表達功能的降低或增加等，最終都會影響TJ 的粘接性能。在眾多蛋白中，Occludin 是TJ 的主要蛋白，相鄰的Occludin 形成的閉鎖小帶是TJ 的關鍵部分。ZO-1的N 端直接結合于Occludin 的C 端，將Occludin 與細胞骨架相連。因此，Occludin、ZO-1 對TJ 結構和功能的穩定性方面起重要作用[11-12]。已有研究發現，Occludin、ZO-1 在DR 大鼠視網膜中表達降低[3]。相關研究發現，糖尿病時BRB 通透性增加與Occludin表達減少有關，大鼠在注射STZ 3 個月后發現視網膜勻漿中Occludin 的含量減少了約35%[13]。本實驗中，用STZ 誘導的糖尿病大鼠中，與模型組相比，通絡駐景丸給藥組大鼠視網膜組織Occludin、ZO-1 的蛋白表達水平及Occludin mRNA 表達水平均有不同程度的升高，其中通絡駐景丸高劑量組升高最多。這些結果與前人實驗結果一致，表明通絡駐景丸具有通過提高視網膜緊密連接蛋白中的咬合蛋白Occludin、帶狀閉合蛋白ZO-1 的表達水平和Occludin mRNA 含量，進而起到保護血-視網膜屏障的作用，抵御DR 的進一步發展。

駐景丸首見于宋代官修方書《太平圣惠方·卷第三十三·治目昏暗方》，具有補益肝腎，清肝明目的作用，是治療眼科疾病的常用方。基于對駐景丸、加減駐景丸、駐景丸加減方的深入研究、臨床應用和動物實驗的不斷探索總結的基礎上，創制形成通絡駐景丸[14]。方中含熟地黃、菟絲子、車前子、三七、蒲黃等藥，具有滋陰活血、化瘀止血、通絡明目之效，穩定血管內環境，發揮減輕DR 病癥的作用[15]。本研究顯示通絡駐景丸可以通過提高緊密連接蛋白中的咬合蛋白Occludin、帶狀閉合蛋白ZO-1 的表達，進而增強BRB，提示通絡駐景丸對BRB 的保護效應。另外課題組目前僅研究了通絡駐景丸對Occludin、ZO-1 兩個主要蛋白的影響，至于通絡駐景丸對其他緊密連接蛋白的影響，仍需下一步深入研究。