生長分化因子11對2型糖尿病小鼠胰島β細胞保護作用的研究

修賢杰 辛 恬 張 萍

佳木斯大學醫學部臨床醫學院，黑龍江省佳木斯市 154000

2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)是臨床常見病和多發病，關于其研究受到了社會的廣泛關注。研究發現，在T2DM患者病情發展過程中，進行性β細胞數量的減少及其功能紊亂扮演著非常重要的角色，是造成病情惡化的重要病機之一[1]。生長分化因子11(Growth differentiation factor 11，GDF-11)屬于轉化生長因子β家族不可缺少的一員，對人體器官的作用集中表現在調控作用方面[2]。近年來，大量學者研究發現，外源性補充GDF-11能夠有效改善多種與年齡相關的器官衰老表現，常見的如心肌肥厚、骨骼及損傷等[3]。另有研究報道顯示，對于老齡小鼠心臟的損傷，給予GDF-11能夠有效促進損傷修復[4]。目前，臨床對于GDF-11作用于小鼠血脂代謝紊亂的報道較多，但是關于對小鼠胰島β細胞的作用機制研究相對較少，外源性補充GDF-11對T2DM小鼠胰島β細胞的保護作用如何仍舊值得探究。為此，本研究以T2DM小鼠作為研究對象展開相關分析，現將情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡的SPF級雄性C57BL/6J野生型小鼠共30只，體重15～20g，平均體重(17.45±3.26)g，均購于常州卡文斯實驗動物有限公司。高脂飼料、鏈脲佐菌素(STZ)分別購于北京華阜康生物科技股份有限公司、美國Sigma公司。人重組GDF-11蛋白購于美國Pepro Tech公司。其他材料主要為實驗操作所需的材料，如小鼠胰島素、ELISA試劑盒、血糖儀及試紙、血脂生化指標檢測試劑盒、糖化血紅蛋白(HbA1c)試劑盒、兔抗人胰升血糖素抗體(1∶100，美國Ab-cam公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 GDF-11的注射：將30只小鼠分為3組，其中采用GDF-11干預的視為干預組，余下10只未采用GDF-11干預視為未干預組，另外10只不進行造模視為正常對照組。正常對照組實施普通飼料喂養，干預組和未干預組給予高脂飼料喂養，均持續喂養4周。4周后，對干預組一次性腹腔注射STZ(100mg/kg)，未干預組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。STZ注射14d后，剪尾測定各組小鼠血糖水平，連續2d血糖≥13.9mmol/L的小鼠被視為造模成功。

1.2.2 生化指標檢測：小鼠禁食12h，腹腔注射60mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，打開腹腔，后腔靜脈采血，離心后取血清，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清胰島素、胰升糖素、TG、TC、FFA、HbA1c水平,按照相應說明書進行操作。剝離完整胰腺，用液氮保存，用于測定組織中胰島素及胰升糖素含量。

1.2.3 小鼠胰島分離：小鼠麻醉并剖腹，利用手術鉗將膽管末端予以夾閉，在肝管匯合處(左、右匯合處)，對膽總管行穿刺處理，將膠原酶溶液2.3ml緩慢注射其中，其目的是促使胰腺能夠均勻膨脹，而后對胰腺進行迅速分離，并置于備好的Ⅴ型膠原酶的 Hank’s平衡液中消化。

1.2.4 RT-PCR檢測：采用Trizol試劑提取胰島總RNA，逆轉錄成cDNA，熒光實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)對肌腱膜的纖維肉瘤腫瘤基因同系物A(MafA)、胰島胰腺十二指腸同源盒1(Pdx-1)、Nkx6轉錄因子相關1(Nkx6.1)等β細胞關鍵轉錄因子表達水平。

2 結果

2.1 各組生化指標水平比較 干預4周后，與正常對照組相比，干預組體重、攝食量、FBG、HbA1c和血脂指標水平更高(P<0.05)；與未干預組相比，干預組體重、攝食量、FBG、HbA1c和血脂指標水平明顯更低(P<0.05)。詳情如表1所示。

表1 各組生化指標水平比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與未干預組相比，△P<0.05。

2.2 GDF-11上調T2DM小鼠胰島β細胞功能重要基因表達 干預組Pdx-1、MafA、Nkx6.1的表達明顯高于未干預組(P<0.05)，且與正常對照組差異不明顯(P>0.05)，詳情如表2所示。

表2 各組GDF-11對胰島β細胞特異性轉錄因子基因表達的影響

注：與正常對照組相比，*P>0.05；與未干預組相比，△P<0.05。

3 討論

T2DM在臨床上較為常見，屬于代謝性疾病的一種，具有較高的發病率，近年來受到人口老齡化趨勢加劇、人們生活和工作方式以及飲食結構轉變等因素影響，其發病率呈現出逐年上升的趨勢[5]。對于T2DM患者而言，隨著病情的不斷進展，若血糖控制不理想可導致病情惡化，引發相關并發癥，如糖尿病足、糖尿病腎病等，甚至造成患者死亡，嚴重威脅到了人們的健康乃至生命安全[6]。因此，加強對T2DM相關發病機制的研究至關重要。

在T2DM的發生和發展過程中，胰島素扮演著非常重要的角色，是T2DM患者病情改善和加重的重要風向標[7]。研究表明[8]，在胚胎發育過程中，對于胰島素的成熟及機體代謝的改善，GDF-11均可在其中發揮重要的作用，而這臨床相關研究也比較常見，但是關于GDF-11對成年胰島β細胞的作用研究很少。研究發現，在糖尿病患者機體循環中，GDF-11水平與不良事件(如并發癥、死亡等)的發生率呈負相關[8]。另有關于心血管疾病的研究認為，患者的GDF-11水平與糖尿病發生的風險呈正相關[9-11]。本研究結果顯示，補充循環中的GDF-11對糖尿病小鼠FBG及HbA1c有明顯的降低作用，可促進糖耐量的改善，但是進一步對體重和攝食量進行分析后發現隨著GDF-11的變化并無明顯改變，提示GDF-11的降糖作用不依賴于體重及食欲的改變。對于正常小鼠的血糖HbA1c及糖耐量而言，GDF-11的變化對其造成的影響并不明顯，表明GDF-11對正常小鼠作用是安全的，這與臨床相關文獻報道一致。在李歡等[12-13]學者的研究中，針對GDF-11對胰島β細胞的影響進行了分析，結果發現GDF-11可改善胰島β細胞功能及維持β細胞含量，進而延緩糖尿病的發生發展。研究發現，胰島β細胞數量對于維持機體正常糖代謝穩態具有重要意義[14]。在糖尿病中，除了β細胞功能紊亂外，β細胞數量下降也是導致高血糖的主要原因。因此，找到維持β細胞數量的方法對于延緩糖尿病進展十分重要[15]。本實驗中，GDF-11不僅可以修復正常胰島形態結構，而且可能通過維持β細胞含量改善高血糖，但是由于相關方面的研究報道并不多見，本研究結果得出該結論的可信度仍舊有待提升，這需后續研究的進一步挖掘和深化。

綜上所述，GDF-11對糖尿病小鼠胰島β細胞具有顯著的保護作用，其作用機制可能與降低血脂，抑制胰升血糖素的釋放，上調重要β細胞轉錄因子，進而改善β細胞功能及維持β細胞數量有關。