不同釀造醋的抗氧化性能的對比研究

陳 怡，范茹茹，吳 凱，胡衛東，蔣立文*

(1.湖南農業大學食品科學技術學院， 長沙 410128； 2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，長沙 410128；3.長沙玉和釀造有限公司， 長沙 410129 )

醋作為液態調味品可由單獨或混合使用各種含有淀粉、糖的物料或酒精，經微生物發酵釀造而來[1，2]。醋屬于5種基本味道之一，在我國有著3 000多年的歷史[3]，醋古稱為“酢”，別名“醯”，又稱苦酒和“食總管”[4]。在我國公元前11世紀就開始制作食醋，《齊民要術》中也談及了釀醋方面的知識[5]。食醋的分類可分為釀造醋和調配醋，釀造醋又可分為固態發酵醋和液態發酵醋。固態發酵是我國傳統食醋的發酵方式之一[6]，它是指一種或多種微生物僅利用潮濕固態天然物料作為培養基的發酵工藝，其本質是以積累目標代謝產物為目的，在特定的發酵條件下，利用微生物對發酵基質中的有機物分解的代謝過程。采用這種發酵方式釀造的食醋具有濃郁的醇香和酯香、酸味柔和、回甜醇厚等特點[7]，如知名的傳統發酵醋包括山西老陳醋、鎮江香醋、獨流老陳醋、四川麩醋都是采用固態發酵的生產方式，并因獨特的釀造工藝和風味被冠以地理標志保護產品的名號，列入世界非物質文化遺產[8]。由于地理環境的差異，不同食醋之間的主要釀造微生物種類也不同，這也是使其風味自成一派的原因之一。

釀造食醋中有豐富的營養成分，如多種氨基酸[9]、碳水化合物[10]、維生素、有機酸[11]以及多種揮發性氣味[12]。釀造醋還有如殺菌消毒、促進新陳代謝、促進血液循環、開胃消食等功能[13]。隨著社會的進步，人們對食品營養保健作用的意識加強，食醋的功能特性受到人們的廣泛關注[14，15]。食醋的抗氧化性是食醋保健功能的一個很重要的方面，現有的許多疾病與自由基導致的生物大分子氧化損傷有關[16]，尤其是活性氧如羥基自由基、超氧陰離子自由基等與心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等有密切關聯[17，18]。研究表明：陳醋與香醋中含有較高的抗氧化成分，并且其抗氧化活性很強，這與其釀造原料中的內含物有很大的關系[19]；帶皮殼的雜糧醋對DPPH·的清除能力和總抗氧化作用比去皮殼雜糧醋高，這與殼中所含的多酚類物質有密切的關系[20]?？寡趸钚晕镔|，無論是對食品還是生物體都具有很重要的作用，但是由于測定抗氧化活性的方式不同，所得到的結果差異較大，且沒有一種單一且有效的試驗方法可以用來精確評價抗氧化活性，所以需要通過多種試驗方法、統計方法來完整地評價抗氧化活性。本試驗在市面購買了12種不同類型、不同時間的陳釀醋，并對其總多酚、黃酮含量以及總抗氧化、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率進行測定，通過相關性、主成分分析等統計方法進一步分析抗氧化性能的變化規律及特點，為食醋的抗氧化性以及保健功能的深度挖掘提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品清單如表1。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)購于梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；蘆丁、沒食子酸購于成都曼思特生物科技有限公司；福林酚購于合肥博美生物科技有限責任公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋購于天津市泰斯特儀器有限公司；752型紫外可見分光光度計購于上海光譜儀器有限公司；島津AUY220微量分析天平。

1.3 方法

1.3.1 總多酚含量的測定

參考劉東波等[21]與張強等[22]的方法，略有改動，采用Folin-酚比色法進行測定。標準溶液制備、供試品濾液的制備以及標準曲線的繪制與參考文獻[21]和[22]一致。在765 nm波長處測出吸光度A(absorbance)值，擬合的標準曲線方程為：y=0.113 3x+0.016 5，相關系數r2=0.997 1(圖1)。樣品含量測定：吸取供試品溶液3份，每份0.5 mL置于10 mL比色管中，按照同樣方法分別測吸光度(A)。從而計算出其含量。

總多酚含量(mg/L)=總多酚含量測得值×樣品稀釋倍數×濾液稀釋倍數

表1 樣品清單Tab.1 The sample list

注：上述信息均來自產品標簽。產品執行標準號：GB/T18187固態發酵

Note:The above information is from the product label. Product implementation standard number:GB/T18187 solid fermentation

圖1 沒食子標準曲線Fig.1 Standard curve of polyphenol

1.3.2 總黃酮含量的測定

參考白立敏等[23]的方法略有改動，采用硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定。對照品溶液的制備:精確稱取蘆丁對照品40 mg，置于100 mL容量瓶中，加60%乙醇40 mL后置于25 ℃水浴，超聲輔助使其完全溶解，放冷后用該乙醇稀釋定容。供試品溶液的制備與標準曲線繪制的操作與參考文獻[23]一致，在波長510 nm處測吸光度值(A)。標準回歸方程為y=0.009 8x+0.001 2，相關系數r2=0.999 1(圖2)。樣品含量測定：精確吸取供試品溶液3份，每份0.5 mL置于10 mL容量瓶中，按上述試驗方法分別測吸光度值(A)，計算出總黃酮的含量。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin

1.3.3 羥自由基(·OH)清除率的測定

根據劉東波等[21]的方法略有改動。損傷管A1：5 mmo1/L的鄰二氮菲溶液1.5 mL，加入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液2.0 mL，充分混勻后，加入7.5 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL，立即混勻后再加入1.0 mL/L的H2O21.0 mL，以蒸餾水補充至10 mL，37 ℃水浴保溫1 h，在510 nm處測定吸光度。未損傷管A0：與上述方法差別在不加H2O2和提取物。試樣溶液管A2：在損傷管測完后加入12種不同醋液1 mL。按下式計算清除率:

·OH清除率(%)=(A2-A1)×100%/(A0-A1)

式中:A0為未損傷管的吸光度；A1為損傷管的吸光度；A2為試樣溶液管的吸光度。

1.3.4 DPPH·清除率的測定

取1.5 mL樣品液于試管中，加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·溶液，混合均勻，反應30 min后在513 nm處測定其吸光度，同時測定樣品空白以及不加樣品液的空白吸光度。按下式計算其對DPPH·抑制率：

抑制率(%)=[A0-(A1-A2)]×100%/A0

式中：A1為1.5 mL DPPH·溶液+1 mL樣品液的吸光度；A2為1 mL樣品液+1.5 mL無水乙醇的吸光度；A0為1.5 mL DPPH·溶液+1 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.5 超氧陰離子(O2-·)清除率的測定

抗超氧陰離子自由基測定按照南京建成生物工程研究所試劑盒所描述的方法(表2)進行。按下式計算抗超氧陰離子。

抗超氧陰離子(U/L)=標準品濃度×1 000 mL

×樣品測試前稀釋倍數×(A對照-A測定)/(A對照-A標準)

表2 抗超氧陰離子自由基的測定操作步驟Tab.2 Procedure for determination of anti-superoxide anion free radical

注:混勻，靜置10 min，波長550 nm，光徑1 cm，雙蒸水調零，測定各管吸光值

Note:Blending, place 10 min, the wavelength of 550 nm, 1 cm diameter, double distilled water zero, determine the absorbance values

1.3.6 總抗氧化能力的測定

總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)測定按照南京建成生物工程研究所試劑盒所描述的方法(表3)進行。按下式計算。

表3 總抗氧化能力測定操作步驟Tab.3 Operation steps of determination of T-AOC

注：混勻，放置10 min，波長520 nm，1 cm光徑，雙蒸水調零，測定各管吸光值

Note:Blending, place 10 min, the wavelength of 520 nm, 1 cm diameter, double distilled water zero, determine the absorbance values

1.4 數據分析

試驗平行測定3次，采用SPSS18.0、Excel2003、origin9.0軟件對其數據進行數理統計分析與相關性分析，采用降維法對釀造醋的抗氧化性能進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 總多酚、總黃酮含量變化

12種不同的釀造食醋的總多酚、總黃酮含量變化如圖3和圖4所示。

圖3 不同釀造醋樣品中總多酚含量變化規律Fig.3 Changes of total polyphenols in different vinegar samples

圖4 不同醋根據多酚高低含量順序排列的總黃酮含量變化Fig.4 The content of total flavonoids in different vinegar ranged according to the content of polyphenols

高粱、小麥、大米、豌豆等植物含有豐富的多酚類物質，因此由這些作為釀造原料的食醋也有大量多酚類物質的存在[28]?，F有大量試驗證明，多酚類物質具有較強的抗氧化作用以及抗感染、抗血管疾病等功能[29]。依次測定12種釀造醋的總多酚含量，按照圖1中標準曲線進行計算，圖3為按照不同品牌釀造醋中總多酚含量的高低排序的結果，可以看出，不同品牌總多酚類物質有顯著差異，但均表現出產品標注釀造年份最長的總多酚含量明顯高于相同品牌的其他醋。從各自品牌醋來看，每一個系列不同年份按照總多酚含量排列順序為Z10>Z3>Z6，C5>C3，S10>S5>S3，D8>D5>D4>D3。可從中得知，山西老陳醋、四川麩醋隨著陳釀時間增長，其中多酚類物質含量越高，與這桂青等[26]和閆霞等[27]對山西陳醋抗氧化性的研究基本一致，鎮江香醋中Z3與Z6的總多酚含量差距不大，但Z10明顯高于Z3與Z6，這一結果與沈志遠等[28]對鎮江香醋的功能性研究結果基本一致。釀造醋中的多酚物質最初存在于原料中，在熏醅和陳放過程中發生美拉德反應生成還原性產物，可能是導致同產品醋隨著陳釀年限增長，多酚含量增多的主要原因[29]。同為產品標注3年陳釀的4種醋總多酚含量為C3>S3>Z3>D3，3年陳釀的四川麩醋C3的總多酚含量為(3 870.20±193.11) mg/L高于山西陳醋S3的總多酚含量(3 252.40±112.20)mg/L，且顯著高于鎮江香醋Z3以及獨流老陳醋D3，此結果與馬錦錦等[35]研究結果基本一致。不同品牌結果差異大與生產配料、發酵工藝等有關。

黃酮具有抗氧化活性，可以清除自由基并且可抑制腸道中的革蘭氏陽性腸球菌的生長和繁殖[36]，黃酮類化合物具有抗炎癥、抗腫瘤[31]以及降血脂和保護心臟的作用[32]。黃酮含量按照圖2中標準曲線進行計算，圖4與圖3的排列方式一致，且發現不同醋的總多酚含量變化趨勢與其總黃酮含量趨勢相同，這與喬艷霞等[33]的研究，釀造醋中的總黃酮含量與總多酚含量有較強相關性的結論相符。從圖4中可以得知,總多酚和總黃酮的含量具有明顯相似的變化趨勢,最高值Z10的總黃酮含量為(161.292±8.06) mg/L,而最小值D5的總黃酮含量為(59.120±2.86) mg/L。山西老陳醋總黃酮含量的變化趨勢為S10>S5>S3，與總多酚趨勢一致，這一結果與閆霞等[27]在對山西老陳醋中總酚、黃酮等進行研究時，得到的兩者與抗氧化效果呈顯著正相關的結果一致。同為產品標注3年陳釀的4種醋總黃酮含量為C3>S3>Z3>D3，3年陳釀的四川麩醋C3的總黃酮含量為(110.210±5.11) mg/L，高于山西陳醋S3的總黃酮含量(100.780±5.04) mg/L，且要明顯高于鎮江香醋Z3和獨流老陳醋D3。

2.2 總抗氧化能力變化

12種不同釀造食醋的總抗氧化能力按照不同品牌表現的變化規律如圖5所示。

圖5 不同釀造醋總抗氧化能力變化規律Fig.5 The variation of total antioxidant capacity of different brewing vinegar

從圖5中可以看出，不同品牌不同年份的醋按照總抗氧化能力值從高到低排列順序為Z10>Z3>Z6，C5>C3，S10>S5>S3，D4>D8>D3>D5。四川麩醋、鎮江香醋和獨流老陳醋的總抗氧化能力變化趨勢與其總黃酮和總多酚的排列順序一致。

2.3 DPPH·、·OH、O2-·清除率的變化

12種不同釀造食醋按照釀造年份從長到短排序的DPPH·和·OH、O2-·清除率的變化如圖6所示。

從圖中可知：鎮江香醋的3種自由基清除率都呈現出Z10>Z6>Z3；Z10、Z6、Z3的超氧陰離子清除率(%)分別為(223.300±11.16)、(135.55±6.78)、(129.610±6.74),DPPH自由基基清除率(%)分別為：(390.528±19.52)、(387.220±19.33)、(363.436±18.17),羥基自由基清除率(%)分別為：(93.500±4.53)、(91.010±4.55)、(87.000±4.35)。其數據變化不僅符合自由基清除率強度隨釀造年份的增長而增強的規律，也與總黃酮、總多酚含量以及總抗氧化能力一致，表明3種自由基清除率之間存在相關性。山西老陳醋的超氧陰離子與DPPH自由基清除率的增減趨勢相同，均為S3>S10>S5。其中S3的超氧陰離子、DPPH自由基清除率(%)分別為(371.290±18.56)、(80.860±4.04),明顯高于另外兩種年份。羥基自由基清除率的增減趨勢為S10>S3>S5，其中S3與S5的數值差距不大，S10的數值為(179.160±8.95)%,顯著高于以上2種。獨流老陳醋的超氧陰離子與羥基自由基清除率的變化都符合D5>D4>D8>D3的趨勢，獨流老陳醋8、5、4年的超氧陰離子自由基清除率相差較小，而3年的明顯低于這3種年份。DPPH自由基清除率的增減趨勢為D5>D8>D4>D3，其中最大清除率與最小清除率相差(24.330±1.21)%。四川麩醋的3種自由基清除率都呈現出C5>C3的趨勢，C5與C3的的超氧陰離子、DPPH自由基、羥基自由基清除率(%)分別為：(382.590±19.12)、(94.720±4.73)、(153.710±7.68)，(353.524±17.67)、(72.410±3.62)、(122.020±6.10)，且數據相差較大，表明隨著釀造年限增長導致其自由基清除率的強度變大的趨勢明顯，其變化規律與總抗氧化能力、總黃酮含量以及總多酚含量的變化趨勢一致。

圖6 不同醋的DPPH·、O2-·、·OH清除率的變化Fig.6 Change in DPPH· ,superoxide anion and hydroxyl free radical scavenging rate of vinegar

選取產品標注釀造年限同為3年的不同品牌的4種醋發現，超氧陰離子和羥基自由基清除率的變化趨勢一致，均為S3>Z3>C3>D3,這說明這2種自由基清除率存在很大的相關性[21]。

2.4 抗氧化相關性分析

表4采用Pearson’s相關系數分析了各個品牌釀造食醋隨著釀造年限的增長，其中的自由基清除性能與總多酚、總黃酮含量具有相關性，結果表明：隨著釀造年限的增長，鎮江香醋的總多酚、總黃酮、·OH清除率互為極顯著正相關，總多酚含量和O2-·清除率、DPPH自由基清除率互為顯著相關；山西老陳醋的總多酚、總黃酮、·OH清除率互為極顯著相關，O2-·清除率與總多酚與總黃酮含量顯負顯著相關；隨著釀造年限的增長，獨流老陳醋的O2-·清除率與DPPH·清除率互為極顯著相關，總多酚、總黃酮互為極顯著相關，·OH清除率分別與DPPH·清除率和O2-·清除率互為顯著性相關。研究表明，天然抗氧化劑主要來源于植物多酚，其中以黃酮類的化合物最為常見，其共同結構為C6-C3-C6[34]，因此這3種醋的總多酚和總黃酮均顯示為極顯著相關。自由基(O2-·、·OH)和DPPH·的氧化與機體內的電子鏈傳遞有很高的相關性[35]，這也可能是這3種自由基互相之間有較高的相關性的原因之一。

表4 自由基清除能力與總多酚和總黃酮含量的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of free radical scavenging ability and total polyphenols and flavonoids content

注：**P<0.01，表示相關性極顯著；*P<0.05，表示相關性顯著

Note:**P<0.01 indicates extremely significant correlation;*P<0.05, indicating significant correlation

2.5 抗氧化性能主成分分析結果

由圖7可知，五種不同的抗氧化指標在主成分分析圖上有較好的分類，羥基自由基、總多酚、總黃酮為一類，超氧陰離子、DPPH自由基為第二類。主成分1(principal component 1，PC1)、主成分2(principal component 2，PC2)分別解釋了變量76.13%、17.37%，累貢獻率為93.5%,因此這2個主成分能夠代表整體數據的基本信息特征。O2-·清除率和DPPH·清除率聚集在第一象限，這一類與PC1、PC2成很高的正相關性，即在PC1、PC2坐標正向，PC1、PC2越大，O2-·清除率和DPPH·清除率取值越大。第二類聚集在第四象限，說明與PC2成很高的負相關性，即在PC2坐標正向，PC2越大，·OH清除率、總多酚、總黃酮取值越小。上述變量均在PC1上成很好的正相關性,且總多酚含量、·OH清除率與PC1相關性最高，說明二者對釀造醋中抗氧化性能的貢獻最高。

圖7 抗氧化性能的主成分分析Fig.7 Principal component analysis of antioxidant properties

3 討論

近年來，抗氧化物質的研究在食醋或者其他食品領域應用廣泛，但是由于測定抗氧化活性的方式不同所得到的結果差異較大，且沒有一種單一且有效的試驗方法可以用來精確評價抗氧化活性，所以需要通過多種試驗方法、統計方法來完整地評價抗氧化活性[36]。本試驗對4類共12種不同年份的釀造醋中的總多酚、總黃酮、總抗氧化能力和3種自由基(·OH、DPPH·、O2-·)清除率進行了分析，評價釀造食醋的抗氧化能力,結果發現，鎮江香醋、四川麩醋、山西老陳醋的總黃酮含量、總多酚含量以及總抗氧化能力都隨著產品標注的陳釀年限增長而增加，這與弓耀忠等[37]得出的山西老陳醋中的抗氧化物質在生產中熏醅階段大量產生，陳釀階段得以富集的結論一致。且在比較產品標注同為3年的醋時，發現麩醋的總黃酮、總多酚含量與其他醋相比都為最高，其總抗氧化能力值也較高，這可能與麩醋在釀制過程中使用了大量的麥麩，其中含有豐富的酚酸類化合物、黃酮類化合物以及維生素E。且麩醋是四大名醋中唯一采用藥曲作為糖化發酵劑的藥醋，其中加入當歸、砂仁、肉桂、紅梅、陳皮等中草藥[38，39]。獨流老陳醋、四川麩醋和鎮江香醋的3種自由基(·OH、DPPH·、O2-·)清除率的變化趨勢一致，山西老陳醋在上述6種抗氧化活性指標的測定排序中都處于前列，這與山西老陳醋在釀造過程中的熏醅脫不開關系。有研究發現熏醅有利于老陳醋的抗氧化活性，熏醅中美拉德反應產生的類黑精及溶解性多酚可為其抗氧化活性提供重要的貢獻[40，41]。試驗通過相關性分析表明，上述幾種釀造醋的總多酚、總黃酮含量、總抗氧化能力以及3類自由基清除能力均顯示為極顯著相關。主成分分析表明，DPPH·清除率、·OH清除率與PC1相關性最高，說明二者對釀造醋中抗氧化性能的貢獻最高。