中藥抗高原病方的抗缺氧效能及其機制研究

高原反應是指短期內由平原進入高原，或由低海拔地區進入到高海拔地區時，由于對低氧環境的適應能力不全或失調而發生腦肺綜合征[1]。正常人進入高原后，會因為高原低壓低氧的環境而導致缺氧，會出現頭痛、頭暈、心悸、胸悶、睡眠障礙、惡心、嘔吐等臨床癥狀。這些高原反應嚴重影響了正常人的工作和生活，更嚴重影響了我軍行軍速度與作戰能力[2]。因此，積極采取措施預防和治療機體缺氧，對高原反應的防治有舉足輕重的作用。國外常使用利尿藥、腎上腺皮質激素、醋氮酰胺等藥物防治高原病，但療效不理想，且有一定的不良反應[3-4]。中藥大多由天然植物組成，安全性較好，近年來中藥用于急性高原反應防治的研究也有了很大的進展。本研究的 “抗高原病方”是由8味中藥材組成，是根據經典名方“丹參飲”經過幾代中醫的臨床經驗，在實踐中不斷改進的中藥復方。此藥方中丹參具有活血化瘀，養血安神的功效，為君藥；三七助丹參活血化瘀，西洋參益氣養陰，紅花活血定痛，共為臣藥；砂仁、檀香行氣止痛，山楂消食和胃，共為佐藥；冰片開竅醒腦，并引諸藥上達顛頂，以止頭痛，為使藥。本研究通過小鼠密閉缺氧實驗來評價抗高原病方的抗缺氧能力及其機制研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性昆明小鼠（KM小鼠），SPF級，體質量18～20 g，購自北京科宇動物養殖中心，動物合格證號：SCXK（京）2018-0010。恒溫、恒濕標準條件下飼喂、自由飲水并自動控制晝夜節律。

1.1.2 藥物與試劑 抗高原病方由空軍特色醫學中心自制國，紅景天購自四川省佳匯泰生物科技開發有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（20190510）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（20190327）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒（20190321）、過氧化氫酶（catalase，CAT）測試盒（20190304）、過氧化氫（H2O2）測試盒（20190516）、乳酸（lactic acid，LD）測試盒（20190522）均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.3 儀器 小鼠密閉缺氧瓶（裝有約5 g鈉石灰的125 ml廣口瓶以橡皮塞密閉，空軍特色醫學中心自制）；PL-203電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KH-Ⅲ全自動研磨儀和MX-F渦旋混合器均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；JY92-Ⅱn 超聲細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心 機購自力康生物醫療科技控股有限公司；Epoch酶標檢測儀購自美國伯騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 密閉缺氧實驗 將72只雄性小鼠適應性喂養1周后，按照體質量隨機分成6組，各組灌胃給藥1次/d。對照組及缺氧模型組給予等體積生理鹽水，紅景天組劑量為0.078 g/（kg·d），抗高原病方低、中、高劑量分別為0.78 g/kg、1.56 g/kg、3.12 g/kg。連續給藥15 d后，除對照組外將其余小鼠單個置于裝有約5 g鈉石灰的125 ml廣口瓶中，以橡皮塞密閉，密切觀察記錄動物死亡時間。依照實驗組與對照組動物存活時間（min），并對組間結果進行方差分析。

1.2.2 生化指標測定 完成缺氧密閉實驗后，取小鼠腦組織和心臟組織，置-80 ℃冰箱中保存。將組織樣本制成10%組織勻漿，運用試劑盒檢測組織中MDA、LD、H2O2、SOD、GSH-Px、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和CAT的含量。

1.3 統計學處理應用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗高原病方對小鼠體質量的影響分別在第1、8、15天測定小鼠的體質量，結果顯示各組小鼠體質量均呈增加趨勢。與對照組比較，抗高原病方低、中、高劑量組對小鼠體質量均差異無統計學意義（P＞0.05），而紅景天組小鼠體質量均增加（P＜0.05）（表1）。

表1 抗高原病方對小鼠體質量的影響（n=12）

2.2 抗高原病方對小鼠抗缺氧能力的影響與缺氧模型組比較，紅景天組小鼠存活時間差異無統計學意義，而抗高原病方低、中、高劑量組小鼠存活時間增加，小鼠存活時間分別增加了14.45%、21.62%、44.84%，表明抗高原病方能夠顯著提高小鼠抗缺氧能力；與紅景天組比較，抗高原病方低、中、高劑量組小鼠存活時間增加，差異均具有統計學意義（P＞0.05），表明抗高原病方抗缺氧能力顯著優于紅景天（表2）。

表2 抗高原病方對小鼠在密閉缺氧條件下存活時間的影響（n=12）

2.3 抗高原病方對缺氧小鼠心臟和腦組織中MDA、GSH-Px和SOD的影響與對照組比較，缺氧模型組、紅景天組和抗高原病方組小鼠心臟組織中MDA水平均顯著升高，并在抗高原病組中隨著給藥劑量的增加而不斷增加；同時GSH-Px和SOD的含量也增加（P＜0.05）。與缺氧模型組比較，紅景天組和抗高原病方中、高劑量組小鼠心臟組織中MDA的含量顯著增加，GSH-Px和SOD的含量僅在抗高原病方組中顯著增加，差異有統計學意義（表3）。與對照組比較，缺氧模型組、紅景天組和抗高原病方組小鼠腦組織中MDA水平均顯著升高，并且抗高原病方組中MDA的含量隨著抗高原病方的劑量的增加而降低；小鼠腦組織中GSHPx的含量僅在抗高原病方低、中劑量組以及紅景天組顯著增加，而SOD的含量在抗缺氧模型組、紅景天組以及抗高原病方低、中劑量組顯著增加。與缺氧模型組比較，紅景天組和抗高原病方組小鼠腦組織中MDA的含量均顯著增加，GSH-Px的含量在抗高原病方低、中劑量組以及紅景天組顯著增加，而SOD的含量僅在抗高原病方低、中劑量組顯著增加（表4）。

表3 抗高原病方對小鼠心臟組織中MDA、GSH-Px和SOD的影響（n=12）

表4 抗高原病方對小鼠腦組織中MDA、GSH-Px和SOD的影響（n=12）

2.4 抗高原病方對缺氧小鼠心臟和腦組織中H2O2和CAT的影響與對照組比較，缺氧模型組、紅景天組和抗高原病方組小鼠心臟組織中H2O2水平均升高（P＜0.05），而CAT的含量在抗高原病方組中升高。與缺氧模型組比較，小鼠腦組織中CAT的含量在紅景天組和抗高原病方高劑量組中顯著升高，而H2O2的水平有一定程度的升高但差異無統計學意義（表5）。

表5 抗高原病方對小鼠心臟組織中H2O2和CAT的影響（n=12）

與缺氧模型組比較，小鼠腦組織中H2O2的含量在缺氧模型組、紅景天組和抗高原病方組中較對照組均升高，并且在抗高原病方組中其含量隨著抗高原病方的劑量的增加而降低；而CAT的含量僅在缺氧模型組中升高；與缺氧模型組比較，H2O2的含量在抗高原病方低劑量組中顯著升高（P＜0.01），CAT的含量在紅景天組和抗高原病方中、高劑量組中降低（P＜0.05）（表6）。

表6 抗高原病方對小鼠腦組織中H2O2和CAT的影響（n=12）

2.5 抗高原病方對缺氧小鼠心臟和腦組織中LD和LDH的影響與對照組比較，乳酸的含量僅在抗高原病方高劑量組小鼠心臟組織以及抗高原病方低劑量組腦組織中升高（P＜0.05），與缺氧模型組比較，乳酸的含量僅在抗高原病方低劑量組中顯著升高（P＜0.01），而乳酸脫氫酶僅在小鼠腦組織中檢測到，且僅在紅景天組中升高（P＜0.05）（表7）。

表7 抗高原病方對小鼠心臟和腦組織中LD和LDH的影響（n=12）

3 討論

高原環境的特點是低壓缺氧，未經習服人員快速從平原進入高原地區時，往往會出現頭痛、惡心、腸胃不適、睡眠不佳等急性高原病癥狀[5]。急性高原病是危害急進高原人群健康的常見疾病，嚴重時可發展為高原腦水腫，危及生命[6]。目前，乙酰唑胺是目前國際上公認預防急性高原病的藥物，是美國食品藥品監督管理局批準的該適應證的唯一藥物[7]，但由于其可引起四肢及面部麻木感、嗜睡、多尿、口渴、耳鳴和胃腸道不適等，甚至導致腎衰等不良反應，限制其廣泛使用[8]。因此，積極研究尋找新的高效、安全的預防急性高原病的藥物是當前高原醫學研究的重點之一。本研究中抗高原病方是根據經典名方“丹參飲”經過幾代中醫的臨床經驗，在實踐中不斷改進，經過理論研究的可行藥方。本研究通過小鼠密閉缺氧實驗發現抗高原病方能夠劑量依賴性地顯著延長小鼠的存活時間，其作用顯著優于紅景天，表明抗高原病方確實能夠增強小鼠的抗缺氧能力。

低壓缺氧誘導的氧化應激會對機體多個器官造成損傷，特別是腦組織[9]。大腦組織耗氧量大，含有高濃度的不飽和脂肪酸以及豐富的金屬離子，同時抗氧化酶的含量較低，這些因素使其對高原缺氧造成的氧化應激非常敏感[10-11]。有研究表明，低壓缺氧條件下會嚴重影響腦組織結構和功能，特別是神經認知功能和空間記憶能力[11-14]。雖然低壓低氧導致腦損傷的機制尚不完全明確，但是目前公認過度的反應氧蓄積是造成損傷的最重要原因之一。因此，該研究中對抗高原病方對小鼠心臟以及腦組織中MDA、H2O2、GSHPx、SOD和CAT氧化應激等相關指標進行檢測，來揭示其改善小鼠抗缺氧能力的作用機制。研究結果顯示，在缺氧條件下，小鼠心臟以及腦組織中氧化應激的標志物丙二醛的含量顯著增加，表明當小鼠暴露于低氧條件下心臟和腦組織的氧化應激明顯增加，并且隨著缺氧時間的延長而逐漸增加，這一結果與其他研究一致[15-17]。同時隨著氧化應激水平的提高，小鼠心臟和腦組織中抗氧化酶（例如SOD和GSH-Px的含量也顯著增加，尤其抗高原病方能夠急劇增加心臟組織中SOD的含量。此外，本研究發現隨著缺氧會導致心臟和腦組織中H2O2的積累，但隨著抗高原病方劑量的增加H2O2的含量而逐漸降低。因此推斷抗高原病方可通過改善缺氧所導致的氧化應激生成和抗氧化劑保護之間的不平衡，從而降低對生物分子的氧化損傷，進而提高小鼠的抗缺氧能力。

大腦作為機體代謝最活躍的器官，對缺氧更加敏感，該研究中缺氧條件下小鼠腦組織中乳酸和乳酸脫氫酶的含量顯著增加，說明腦組織中糖酵解作用增強，有氧氧化過程受抑制，能量供應障礙[17]，而抗高原病方隨著劑量的增加其抗缺氧能力增加，同時會改善LD及LDH在腦組織中的積累。

綜上所述，該研究證明了抗高原病方能夠顯著提高小鼠的抗缺氧效能，其作用主要是通過改善缺氧所導致的氧化應激損傷和抗氧化保護之間的平衡，激活其抗氧化防御能力，對氧化應激做出有效的適應性反應，同時改善機體在缺氧條件下能量的代謝障礙。