反向遺傳學讓疫苗研發更高效

文／謝開飛 通訊員 歐陽桂蓮

在現代遺傳學中，反向遺傳學被認為是一種不可或缺的工具，它徹底改變了人們對病毒發病機制和疫苗研發的認識。近日，一項來自瑞士的研究使用這一工具，依靠已知新冠病毒基因序列，在酵母菌中快速構建出了活的新冠病毒。

研究人員認為，快速構建出活的新冠病毒，可以成為向衛生部門和實驗室提供傳染性病毒毒株的替代方法，從而爭取時間對疫情暴發做出快速反應。該研究中所用的反向遺傳學技術是什么？在生物科技領域有哪些應用？這種重建病毒的最新研究如何改變對疫苗研發的認識？

由里及表 開辟疫苗研發新思路

“一直以來，科學家們研究相關基因的功能，都是通過雜交等手段，觀察表型性狀的變化，從而研究遺傳基因的存在與變化，這種由表及里的研究方法稱為正向遺傳學。”廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心副教授程通告訴記者，如在醫學領域，可以觀察臨床病人病理組織和正常組織的不同表現，從而探究產生這種表現變化的內在原因。

隨著分子遺傳學及相關實驗技術的發展，科研人員已經能夠有目的地對DNA進行重組或者定點突變。于是，在現代遺傳學中，就出現了另一條由里及表的認知路線。研究人員直接從生物自身基因出發，通過對特定基因進行敲除、定點突變等人工操作后，觀察突變體表型與性狀變化，從而反推基因功能。由于該路線與正向遺傳學正好相反，所以這個新的遺傳學分支被稱為反向遺傳學，包括基因剔除技術、基因改造等研究。

相較于正向遺傳學來說，反向遺傳學有其獨特的優勢。

此前，美國哈佛—麻省理工博德研究所科學家塞克·凱斯利森及其同事，就采用反向遺傳學方法，對10503個生活在巴基斯坦的人基因編碼區進行測序分析，識別出了約50000個突變。這種反向推定的技術路線，相當于高效收集了正向敲除1317個基因找到的結果，相較于傳統正向遺傳方法，極大地提高了效率。

“與滅活疫苗、減毒疫苗等經典疫苗研發方法相比，反向遺傳學操作還具有減毒途徑明確、效率高、毒力回復率低等優點，是疫苗研制的新方向。”程通說。

目前，科研人員利用反向遺傳學技術，已證實登革熱病毒、脊髓灰質炎病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒和乙型腦炎病毒等一系列病毒的毒力相關位點，通過基因突變、缺失、重排等方法，都有可能獲得理想的減毒株來研制疫苗。

據介紹，基于反向遺傳學技術的疫苗研究，還可以發現在經典疫苗研發過程中難以發現的“特殊”保護性抗原，為傳染性疾病的疫苗研制，以及發展新型多價或廣譜疫苗提供新的方向和思路。

補充病毒資源 加速檢測技術開發和藥物篩選

在新冠病毒感染者病例已經大規模出現的情況下，科學家們為什么還要對其進行人工重建？程通表示，重建病毒將有助于人類了解病毒復制途徑，找到其“弱點”和藥物作用靶點，是研制病毒相關疫苗與治療藥物不可或缺的技術手段。

雖然新冠肺炎病例已大規模出現，但不同地域毒株常存在差異性，且出于生物安全的考慮，無法在全球范圍內任意運輸，導致眾多科研機構因缺乏新冠病毒資源而難以快速鑒定病毒、驗證相關疫苗或治療藥物的有效性。

“新冠病毒重建技術的突破，使得處于不同國家與地區的科學家，能夠在各自所處的高等級生物安全實驗室內，借助大腸桿菌、酵母菌等基因工程常用微生物，合成當前數據庫里具有完整基因組序列的新冠病毒活毒株。”程通說，這有助于解決相關藥物評價的關鍵資源問題，將加快針對新冠病毒的檢測、治療和預防手段的研發。

另一方面，重建病毒還為發現毒力位點與作用機制等提供了工具。通過對新冠病毒進行基因敲除、改變以及其他加工修飾，研究這些基因改造對其致病性的影響，有助于深入了解病毒致病機制，發現可用作藥物靶點的新型毒力基因。

此外，通過給病毒加上熒光蛋白等可視化標記，還可實現病毒感染實時監控，從而優化現有新冠病毒的細胞與動物感染模型，為相關疫苗與藥物高通量快速篩選進一步提供方便。

目前，國內外科研機構在重建病毒過程中，尚無法脫離反向遺傳學范疇。科研人員大都是基于在大腸桿菌或酵母菌等基因工程類微生物內，克隆與改造病毒遺傳物質，然后將提純的病毒基因組轉運到宿主細胞中進行活病毒的組裝生產。

《科學》雜志曾經報道的脊髓灰質炎病毒重建，由科研人員使用無細胞體外系統完成。由于需要基于該病毒的基因組序列信息來進行實驗，當時就將其歸屬于一種特殊的反向遺傳學操作方式。

應用日益廣泛 但須受到嚴格監管且符合科學倫理

當前，反向遺傳學技術不僅在不同種類病毒研究上得到非常普遍的應用，而且在疫苗和藥物研發上也展現出重要的應用價值。

程通舉例說，基于反向遺傳學技術改造減毒活疫苗的研究，已在包括2009甲型H1N1流感病毒、登革熱病毒、禽流感病毒、水痘—帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、人巨細胞病毒等多種病毒中取得重要進展。

其中，2009甲型H1N1減毒活疫苗已上市并廣泛接種，水痘—帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、人巨細胞病毒和登革熱病毒等病毒的反向遺傳改造減毒活疫苗，已進入臨床試驗階段。

此外，基于反向遺傳學技術合成的減毒病毒載體或溶瘤病毒類藥物，已廣泛用于基因治療與腫瘤治療臨床研究。2015年，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準首個溶瘤病毒類藥物T-VEC用于治療晚期黑色素瘤；2017年，美國杜克大學研發的溶瘤脊髓灰質炎病毒，獲得了FDA的批準，用于治療神經膠質瘤。

除了用于重建病毒，反向遺傳學技術在細菌等其他微生物，以及植物相關研究上也有廣泛應用，并取得了較大進展。

“在細菌研究方面，反向遺傳學技術在B群腦膜炎球菌疫苗、肺炎鏈球菌多價疫苗、肺炎衣原體疫苗、炭疽桿菌疫苗等多種細菌性疾病疫苗的研制中，獲得了成功應用。”程通說。其中，B群腦膜炎球菌通用疫苗的成功研制是運用反向遺傳學技術研發細菌疫苗的經典案例。

B群腦膜炎球菌是流行性腦脊髓膜炎的病原菌，可導致兒童與青少年患急性化膿性腦膜炎和敗血癥。然而長期以來，科學家們應用傳統技術研制有效和廣譜的預防疫苗，一直無法獲得成功。

隨著基因組學和蛋白質組學技術的進步，瑞士諾華公司的研究人員應用反向遺傳學技術，通過分析B群腦膜炎球菌的全基因組，并進一步通過基因組序列比較和動物模型測試篩選，研制出多價B群腦膜炎球菌通用疫苗。

2013年，諾華公司重組B群腦膜炎球菌疫苗獲得歐盟批準上市，成為歐洲第一個獲得批準的預防B群腦膜炎球菌病的疫苗，并在控制B群腦膜炎球菌流行中被證明安全有效。

“需要特別指出，通過反向遺傳學技術重建病毒，是推進相關科學研究的有力工具，但這些實驗操作必須受到嚴格的監管，需符合科學倫理，并嚴格限定在合格的生物安全實驗室中開展。”程通說。