轉(zhuǎn)錄激活因子-4、第二個(gè)線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑在卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義

于欽德，陳傳鳳，吳海衛(wèi)

淄博市第一醫(yī)院1婦科，2腫瘤一科，山東淄博255200

卵巢癌的發(fā)病率較高，嚴(yán)重威脅患者的健康和生命，在部分高危人群中，卵巢癌的發(fā)病率可超過(guò)約578/10萬(wàn)[1]。卵巢癌具有較高的病死率和致殘率，中晚期患者的病情進(jìn)展速度較快，遠(yuǎn)期多器官功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)較高[2]。在研究卵巢癌發(fā)病分子機(jī)制的過(guò)程中，越來(lái)越多的研究關(guān)注到，腫瘤調(diào)控蛋白的改變能夠在卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄激活因子-4（activating transcription factor-4，ATF-4）是轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)因子，能夠提高腫瘤細(xì)胞上游轉(zhuǎn)錄本序列的閱讀開(kāi)放框的激活程度，最終加速卵巢癌細(xì)胞核DNA的異常分裂[3-4]。第二個(gè)線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑（second mitochondria-derived activator of caspase，SMAC）是線粒體活性調(diào)節(jié)因子，能夠通過(guò)穩(wěn)定線粒體和細(xì)胞能量代謝，最終穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程[5]。為了揭示ATF-4、SMAC的表達(dá)與卵巢癌的關(guān)系，從而深入揭示卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，并為卵巢癌的診療提供參考，本研究選取90例卵巢癌患者的卵巢癌組織，探討ATF-4、SMAC蛋白的表達(dá)情況與卵巢癌患者病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年9月至2018年4月淄博市第一醫(yī)院收治的卵巢癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①卵巢癌的診斷符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②卵巢癌組織來(lái)源于手術(shù)后，經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為上皮性卵巢癌；③患者手術(shù)前未接受放化療、免疫學(xué)治療；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并盆腔、腹腔等其他類型腫瘤；②合并生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和盆腔感染性疾病；③伴有免疫系統(tǒng)疾病。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入90例卵巢癌患者，其年齡為36～67歲，平均年齡為（55.1±8.0）歲；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）：I期22例，Ⅱ期37例，Ⅲ期28例，Ⅳ期3例；病灶直徑：≥5 cm 50例，＜5 cm 40例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例；組織學(xué)分級(jí)：G1級(jí)24例，G2級(jí)37例，G3級(jí)29例；病理學(xué)類型：漿液性囊腺癌64例，黏液腺癌26例。另選取90例卵巢良性腫瘤患者，其年齡為38～69歲，平均年齡為（57.8±7.0）歲；黏液性囊腺瘤52例，漿液性囊腺瘤28例，其他類型10例。兩組患者的年齡、FIGO分期等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。分別收集兩組患者的卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行研究。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

收集患者的卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織，3%的過(guò)氧化氫室溫條件下孵育20 min，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3次，每次5 min，采用PBS稀釋后的山羊血清封閉抗體5 min，倒去血清后不清洗，滴加一抗（稀釋濃度為1∶1000）5 ml，37℃孵育2 h，或置于4℃冰箱過(guò)夜孵育，PBS清洗3次，每次5 min，滴加生物素?zé)晒鈽?biāo)記的二抗（稀釋濃度為1∶2000）3 ml，37℃孵育20～30 min，PBS清洗3次，每次5min，加入鏈霉親合素/辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidas，HRP）標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育 20～30 min，PBS清洗3次，每次5 min，采用增強(qiáng)型HRP-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）底物顯色試劑盒（PA110）顯色，自來(lái)水沖洗，復(fù)染，封片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

ATF-4、SMAC蛋白定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)二者染色呈黃色、棕黃色、褐色時(shí)，說(shuō)明為陽(yáng)性表達(dá)。依據(jù)染色程度進(jìn)行評(píng)分：未染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，褐色、黑色計(jì)3分。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分：≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。將染色程度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比的評(píng)分相乘，＜3分為ATF-4、SMAC表達(dá)陰性，≥3分為ATF-4、SMAC表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中ATF-4、SMAC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌組織中ATF-4的陽(yáng)性表達(dá)率為70.00%（63/90），明顯高于卵巢良性腫瘤組織的35.56%（32/90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.422，P＜0.01）。卵巢癌組織中SMAC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為45.56%（41/90），明顯低于卵巢良性腫瘤組織的80.00%（72/90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.848，P＜0.01）。

2.2 上皮性卵巢癌組織中ATF-4、 SMAC蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌患者病理特征的關(guān)系

FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)為G3級(jí)的上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中ATF-4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于FIGO分期為I～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)為G1～G2級(jí)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.582、5.726、7.871，P＜0.05）；FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)為G3級(jí)的上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中SMAC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均低于FIGO分期為I～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)為G1～G2級(jí)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.436、8.897、10.667，P＜0.01）；不同病灶直徑的上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中ATF-4、SMAC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同病理特征上皮性卵巢癌患者上皮性卵巢癌組織中ATF-4、SMAC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況（n=90）

3 討論

較高的基礎(chǔ)發(fā)病率和遺傳傾向均能夠促進(jìn)卵巢生發(fā)上皮細(xì)胞的異常病變，加劇病情進(jìn)展。具有多次流產(chǎn)、月經(jīng)紊亂或多囊卵巢綜合征的患者，其遠(yuǎn)期發(fā)生卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)較高[7-8]。對(duì)于卵巢癌患者病理特征的評(píng)估能夠在卵巢癌的診療及治療方案的制定等方面發(fā)揮作用。腫瘤蛋白或腫瘤標(biāo)志物的研究能夠?qū)υu(píng)估卵巢癌的病理特征提供依據(jù)。雖然血清糖類抗原19-9或糖類抗原125能夠在卵巢癌的診療過(guò)程中發(fā)揮作用，但依靠其單獨(dú)評(píng)估卵巢癌患者病理特征的局限性仍然存在，其對(duì)于卵巢腫瘤患者綜合性病情評(píng)估的可靠性較低[9-11]。計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）等影像學(xué)檢查能夠在卵巢腫瘤患者病情評(píng)估中發(fā)揮作用，但其滯后性較為明顯。本研究通過(guò)對(duì)卵巢癌組織中ATF-4、SMAC蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在為卵巢癌的臨床診療提供更為可靠的參考，提供新的研究方向和參考靶點(diǎn)。

ATF-4是轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)因子，主要表達(dá)于轉(zhuǎn)錄上游啟動(dòng)子開(kāi)放閱讀區(qū)，在轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的激活過(guò)程中，其過(guò)度表達(dá)能夠明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的異常轉(zhuǎn)錄。從分子機(jī)制水平進(jìn)行分析，認(rèn)為ATF-4對(duì)于卵巢生發(fā)上皮細(xì)胞凋亡速率的影響能夠使卵巢癌細(xì)胞的凋亡比例降低。SMAC是線粒體促凋亡蛋白，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜周邊和線粒體膜周邊，在腫瘤細(xì)胞能量獲得或三磷酸腺苷合成過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，ATF-4蛋白在卵巢癌中的表達(dá)濃度明顯上升[12-14]，但對(duì)于SMAC的分析不足。

本研究通過(guò)免疫組化分析可見(jiàn)，卵巢癌組織中ATF-4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，而SMAC的陽(yáng)性表達(dá)率明顯下降，二者在卵巢癌中存在差異性表達(dá)的趨勢(shì)，這主要與ATF-4、SMAC的作用機(jī)制或轉(zhuǎn)錄生成調(diào)控的異常有關(guān)：ATF-4陽(yáng)性表達(dá)率的升高主要與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄信號(hào)通路的激活有關(guān)，而SMAC陽(yáng)性表達(dá)率的下降主要與腫瘤細(xì)胞線粒體穩(wěn)定性下降導(dǎo)致SMAC蛋白的合成減少有關(guān)。陳雨薇等[15]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中SMAC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率可下降30%以上，在卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為惡化較為明顯的組織中，SMAC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率可繼續(xù)下降。不同病理特征卵巢癌患者卵巢癌組織中ATF-4、SMAC蛋白的表達(dá)存在明顯差異，其中，F(xiàn)IGO分期較晚、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度較差的卵巢癌患者卵巢癌組織中ATF-4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率較高，SMAC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率較低，提示ATF-4、SMAC蛋白的差異性表達(dá)與卵巢癌患者的病理特征有關(guān)。ATF-4蛋白對(duì)卵巢癌患者病理特征的影響主要在于ATF-4能夠通過(guò)激活下游絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）或蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號(hào)通路，促進(jìn)卵巢生發(fā)上皮細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；而SMAC陽(yáng)性表達(dá)率的下降對(duì)于卵巢癌患者病理特征的影響主要在于其能夠影響細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的變形和浸潤(rùn)能力的改變，最終影響卵巢癌細(xì)胞的分化、黏附及浸潤(rùn)。但本研究中并未發(fā)現(xiàn)ATF-4、SMAC蛋白的表達(dá)對(duì)于卵巢癌細(xì)胞直徑的影響，提示ATF-4、SMAC的表達(dá)并不會(huì)影響卵巢癌患者的一般性臨床特征。

綜上所述，卵巢癌組織中ATF-4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，SMAC蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯下降，且與卵巢癌的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)情況有關(guān)。ATF-4、SMAC蛋白與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系有待今后進(jìn)一步探索。