基于IL-33/ST2信號通路的茯苓多糖調控潰瘍性結腸炎大鼠肥大細胞活化的機制研究

梁桐爾 劉楊洋 王 烜

(西南醫科大學附屬醫院全科醫學科，瀘州 646000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種累及結直腸的非特異性炎癥性腸病，主要表現為持續、反復腹瀉，排黏液性膿血便，腹痛等癥狀[1]。UC發病因素較為復雜，目前認為其發病可能與感染、免疫、精神等多種因素相關，而免疫因素被認為是主要因素。肥大細胞(mast cells，MC)是一種主要分布于結締組織和黏膜上皮的重要免疫細胞，其胞質含有嗜堿性顆粒[2]。應激狀態下，MC可通過脫顆粒釋放多種炎癥因子，如TA、IL-6等[3]。UC發生過程中，IL-33/ST2信號通路協同IgE介導MC的脫顆粒效應，促進炎癥因子的釋放，啟動炎癥級聯反應[4]。目前西醫治療UC主要采用糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物，但其易引起腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐等不良反應。研究報道茯苓多糖具有增強巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞活性的作用，但其與IL-33/ST2信號通路的研究目前尚未見報道[5]。本研究通過建立UC大鼠模型，給予茯苓多糖灌胃治療，探討茯苓多糖對UC大鼠MC活化的作用機制及對IL-33/ST2信號通路的影響，以期為更合理有效治療UC大鼠，減少治療帶來的不良反應奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠90只由北京大學醫學院實驗動物中心提供，合格證號:SYXK(京)2018-0013，體質量(180±40)g。嚴格按照實驗動物飼養管理規定飼養，溫度18～28℃，濕度 40%～70%。

1.1.2主要儀器與試劑 茯苓多糖購自江方格藥業有限公司；柳氮磺胺吡啶片(SASP)購自上海信宜天平藥業有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)購自上海西格瑪奧德里奇公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自Promega公司；IL-33、IL-5、IL-13、IL-4、IL-6 ELISA試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司；4%多聚甲醛、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液購自羅氏公司；IL-33、ST2單克隆抗體購自CST公司；Anti-beta-Actin、辣根過氧化物酶標記二抗(HRP)購自北京博奧森生物技術有限公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；Olympus BH2顯微鏡購自日本Nikon公司；勻漿機、微量移液槍購自德國 Eppendorf公司；電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的制備 對照組15只，大鼠適應性喂養1周后，除對照組外剩余75只大鼠均建立UC大鼠模型[6]。造模前大鼠禁食24 h，麻醉大鼠后在大鼠肛門處緩慢插入橡膠管約8 cm至結腸，每只大鼠以100 mg/kg注入5%的TNBS與乙醇1∶1 的混合溶液，灌入后倒置大鼠約30 s防止灌注液倒流，隨即平放大鼠至自然清醒，造模后觀察大鼠情況，至第2天大鼠出現排泄稀爛便、甚至出現精神萎靡、膿血便及活動減少等癥狀，說明造模成功。對照組大鼠同采用體積的生理鹽水灌腸。

1.2.2動物分組與給藥 對照組15只，其余75只UC大鼠造模成功后按照隨機數字表法分為模型組、茯苓多糖低劑量組、茯苓多糖中劑量組、茯苓多糖高劑量組、SASP組(陽性對照組)，每組均15只。參考文獻[7]灌注藥物，分組后茯苓多糖低、中、高劑量組按照每天5 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，SASP組300 g/kg SASP灌胃，對照組、模型組每天灌胃生理鹽水10 ml/kg，連續治療14 d。

1.2.3大鼠一般情況的觀察 各組大鼠在試驗期間均無死亡，分別于分組后、治療結束時稱量體質量，實驗期間常規監測大鼠的飲食、嗜睡、懶動、毛色、大小便等情況。并觀察大鼠疾病活動度，對大鼠進行疾病活動指數(DAI)評分，定期觀察大鼠體質、大便隱血、大便性狀情況，按照0～4分進行評分，DAI=體質量下降百分比評分+大便隱血/便血評分+大便性狀評分。

1.2.4樣品的采集 各組動物灌胃14 d后，乙醚麻醉后于尾靜脈取血3 ml，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，-20℃冰箱保存待測。3%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，開腹截取肛門2～10 cm處結腸組織，沿腸系膜剪開腸腔，去除腸黏膜表面黏附的血液、糞便、分泌物，等滲生理鹽水沖洗干凈并吸干水分，稱重；平展腸黏膜組織，肉眼觀察結腸大體形態，進行結腸黏膜損傷指數(CMDI)評分；切取病變明顯結腸組織一部分凍存于-80℃冰箱，一部分固定于4%多聚甲醛。

1.2.5ELISA方法檢測血清IL-33、IL-5、IL-13、IL-6、sST2的水平 采用酶聯免疫吸附測定法 (enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測血清IL-33、IL-5、IL-13、IL-6、sST2的水平，具體操作步驟如下：將1.2.4中抽取的冰凍血液標本和ELISA試劑盒取出后，于室溫平衡30 min，然后按照說明書將試劑盒內標準品配置成所需的濃度備用。分別設待測樣品孔、標準孔和空白孔，然后依次加入待測標本、標準品和辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，經過溫育、洗滌，采用底物四甲基聯苯胺顯色，并用酶標儀在450 nm處測吸光度，繪制標準曲線，計算待測標本濃度。

1.2.6HE染色及免疫組化染色 甲醛固定組織用于HE染色及免疫組化染色，HE染色后觀察結腸組織病理變化，進行組織學損傷(TDI)評分。甲醛固定組織制備切片，免疫組化SP法檢測TA表達水平，HE染色和免疫組化染色均按照試劑盒說明進行操作。

1.2.7甲苯胺藍改良法染色檢測MC形態 取1.2.4中甲醛固定組織，常規石蠟包埋，切片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚間斷切片，采用甲苯胺藍改良法染色檢測MC形態、數目、脫顆粒率，隨機選取3個視野，置于高倍(×400)鏡下觀察，取平均值，計數MC 數量、脫顆粒細胞數目、脫顆粒率，脫顆粒率=脫顆粒細胞數目/MC 數目×100%。

1.2.8Western blot檢測結腸組織IL-33、ST2蛋白水平 取1.2.4中的凍存組織，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，采用RIPA蛋白裂解法提取組織中的總蛋白，冰上裂解45 min，裂解期間間隔混勻組織液，裂解完成后于4℃條件下14 000 g離心15 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，根據測定結果調整所有蛋白樣本為相同濃度后，進行SDS-PAGE電泳分離(10%分離膠和5%濃縮膠)，濕轉全部轉移至硝酸纖維膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入預先按照說明書稀釋好的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜后加室溫孵育對應的二抗2 h，以actin為內參，TBST清洗后ECL顯色曝光得到蛋白條帶，并使用Image J進行條帶分析 。

2 結果

2.1大鼠一般情況觀察 對照組大鼠飲食正常，大小便正常，皮毛光滑；模型組大鼠出現扎堆、嗜睡、厭食、皮毛干枯等表現，3 d后出現大便帶血、少動少食，體重減輕等癥狀；灌腸后茯苓多糖治療組和SASP組大鼠在治療第2周后便血、皮毛干枯、飲食量少等癥狀開始緩解，茯苓多糖中、高劑量組和SASP組大鼠恢復良好。與對照組比較，模型組大鼠日攝食量、日體質量增加量顯著降低，DAI評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，茯苓多糖治療組和SASP組日攝食量、日體質量逐漸增加，DAI評分逐漸降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠結腸組織切片HE染色觀察 對照組大鼠結腸組織切片顯示大鼠腸黏膜形態完整，腺體排列整齊，無水腫、潰瘍；模型組顯示腸黏膜腺體結構排列紊亂，出現水腫、出血、糜爛，腸黏膜上皮損壞，散在潰瘍連續存在，黏膜和黏膜下層較多炎癥細胞浸潤；茯苓多糖各治療組和SASP組肉眼及鏡下結腸損傷較輕，少量潰瘍，炎癥細胞浸潤減輕見圖1。與對照組比較，各組大鼠CMDI、TDI評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，茯苓多糖各治療組和SASP組CMDI、TDI評分均降低，尤以茯苓多糖高劑量組、SASP組降低最為顯著(P<0.05)，見表2。

2.3各組大鼠結腸組織切片甲苯胺藍改良法檢測MC形態及數目 甲苯胺藍染色結果顯示，光鏡下可見近端結腸黏膜固有層和黏膜下層彌散分布肥大細胞，肥大細胞呈卵圓形或梭形，胞漿呈紫色，核藍色，未脫顆粒者形態完整，胞漿均勻，染色呈紫色；脫粒者形態不規則，胞漿顏色較淺，細胞周圍可見紫色顆粒物質(圖2中箭頭所指)。與對照組比較，模型組近端結腸MC數目顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，茯苓多糖低、中、高劑量組和SASP組MC數目顯著減少(P<0.01)，見表3。

GroupsDose ofadministration(g/kg)Average dailyintake(g/d)Average dailyweight gain(g/d)DAI scoresControl-14.68±0.433.73±0.320.23±0.08Model-11.27±0.151)3.08±0.171)2.93±0.311)Poria cocos polysaccharide low dose50 mg/kg11.94±0.201)2)3.11±0.231)2)2.70±0.301)2)Poria cocos polysaccharide medium dose100 mg/kg14.25±0.351)2)3.55±0.221)2)2.00±0.231)2)Poria cocos polysaccharide high dose200 mg/kg14.39±0.391)2)3.62±0.291)2)1.28±0.181)2)SASP300 m/kg 14.52±0.331)2)3.66±0.201)2)1.01±0.111)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖1 各組大鼠結腸組織切片HE染色(×100)Fig.1 HE staining of colon slices of rats in each group(×100)Note: A.Control group；B.Model group；C.Poria cocos polysaccharide low dose group；D.Poria cocos polysaccharide medium dose group；E.Poria cocos polysaccharide high dose group；F.SASP group.

GroupsCMDITDIControl14.74±0.453.75±0.35Model11.33±0.191)3.02±0.201)Poria cocos polysaccharide low dose11.96±0.221)2)3.13±0.251)Poria cocos polysaccharide medium dose13.02±0.311)2)3.25±0.271)2)Poria cocos polysaccharide high dose14.21±0.381)2)3.46±0.311)2)SASP14.60±0.391)2)3.61±0.291)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖2 各組大鼠結腸組織切片甲苯胺藍染色(×400)Fig.2 Toluidine blue staining of colon slices of rats in each group(×400)Note: A.Control group；B.Model group；C.Poria cocos polysaccharide low dose group；D.Poria cocos polysaccharide medium dose group；E.Poria cocos polysaccharide high dose group；F.SASP group.

GroupsMC(n/400 hp)Degranulationrate(%)Control3.14±0.450.45±0.12Model10.33±2.191)0.86±0.201)Poria cocos polysaccharide low dose8.03±2.171)2)0.75±0.181)2)Poria cocos polysaccharide medium dose6.42±1.911)2)0.63±0.081)2)Poria cocos polysaccharide high dose3.75±1.731)2)0.48±0.061)2)SASP3.42±1.371)2)0.46±0.041)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖3 各組大鼠結腸組織TA表達(×400)Fig.3 Expression of TA in colon tissue of rats in each group(×400)Note: A.Control group；B.Model group；C.Poria cocos polysaccharide low dose group；D.Poria cocos polysaccharide medium dose group；E.Poria cocos polysaccharide high dose group；F.SASP group.

GroupsOptical density valueControl172.09±23.45 Model113.89±20.191)Poria cocos polysaccharide low dose133.96±17.221)2)Poria cocos polysaccharide medium dose148.02±15.311)2)Poria cocos polysaccharide high dose160.21±12.381)2)SASP167.60±13.791)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

GroupsIL-33(pg/ml)IL-5(pg/ml)IL-13(pg/ml)IL-6(pg/ml)sST2(ng/L)Control15.10±2.522.21±0.358.52±1.2030.28±6.0258.19±15.52Model39.29±3.321)4.02±0.671)17.21±2.891) 83.25±14.041)180.91±29.261)Poria cocos polysaccharide low dose32.03±3.161)2)3.55±0.451)2)14.91±1.351)2) 60.06±14.151)2) 160.89±24.031)2)Poria cocos polysaccharide medium dose25.29±2.091)2)3.06±0.351)2)11.56±1.571)2) 46.56±9.341)2) 135.68±18.951)2)Poria cocos polysaccharide high dose17.02±2.191)2)2.46±0.311)2)10.39±1.781)2) 35.17±8.121)2) 105.68±17.611)2)SASP15.78±2.161)2)2.41±0.291)2)9.95±2.031)2) 33.26±7.021)2) 94.02±6.151)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

圖4 各組大鼠IL-33、ST2蛋白的表達Fig.4 Expression of IL-33 and ST2 proteins in rats of each groupNote: 1.Control group；2.Model group；3.Poria cocos polysaccharide low dose group；4.Poria cocos polysaccharide medium dose group；5.Poria cocos polysaccharide high dose group；6.SASP group.

GroupsIL-33ST2Control0.35±0.080.10±0.02Model1.10±0.121)1.02±0.111)Poria cocos polysaccharide low dose0.56±0.051)2)0.75±0.071)2)Poria cocos polysaccharide medium dose0.60±0.071)2)0.45±0.081)2)Poria cocos polysaccharide high dose0.36±0.061)2)0.32±0.051)2)SASP0.32±0.041)2)0.11±0.031)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

2.4各組大鼠結腸組織MC的TA表達水平 與對照組比較，模型組結腸TA水平顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，茯苓多糖低、中、高劑量組和SASP組TA水平顯著減少(P<0.01)。

2.5各組大鼠血清sST2及炎癥因子表達水平 與對照組比較，模型組IL-33、IL-5、IL-13、IL-6、sST2水平顯著升高，與模型組比較，茯苓多糖各治療組和SASP組IL-33、IL-5、IL-13、IL-6、sST2水平顯著降低(P<0.05)。

2.6各組大鼠IL-33、ST2蛋白的表達 與對照組比較，模型組IL-33、ST2蛋白水平顯著升高，與模型組比較，茯苓多糖各治療組和SASP組IL-33、ST2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。

3 討論

中醫認為UC的病癥主要是濕熱蘊腸、氣滯絡淤，屬本虛標實之癥[8]。近年來研究表明，UC的發病與機體免疫密切相關，UC患者T淋巴細胞降低，免疫力減弱[9]。茯苓具有澀腸止瀉、清熱燥濕的功效，茯苓多糖可增強T淋巴細胞、B細胞活性，增強巨噬細胞功能，但關于茯苓多糖對MC的作用目前尚不清楚。本研究通過制備UC模型，觀察茯苓多糖對MC及IL-33/ST2通路的作用，結果顯示茯苓多糖治療后，大鼠排膿血便、皮毛干枯、飲食量減少等癥狀得到緩解，且治療組大鼠DAI評分顯著降低，提示茯苓多糖可降低UC大鼠的臨床病理癥狀。SASP屬于磺胺類藥物，是治療大鼠潰瘍性結腸炎的常用藥物。本研究中，與茯苓多糖治療組比較，SASP組治療效果更優，但長期使用SASP易引起嘔吐、藥物熱、白細胞減少等不良癥狀，故選擇中藥代替西藥，進一步分析結腸黏膜病理結構和MC數目及炎癥因子水平。

UC是嚴重的腸道炎癥性疾病，主要表現為腸道腺體結構排列紊亂、炎癥細胞浸潤等典型的組織學特征，是一種自身免疫性疾病[10]。本研究采用茯苓多糖治療UC大鼠，治療后大鼠結腸損傷減輕，炎癥細胞浸潤減弱，腸黏膜水腫減輕，提示茯苓多糖可通過抑制結腸黏膜的炎癥細胞緩解UC癥狀。黏膜免疫在腸道炎癥和損傷中發揮重要作用，淋巴細胞活化參與UC的發生[11]。目前認為UC是個體對腸腔內正常促炎因子的異常反應引起的免疫失調，MC可能是這一過程的關鍵因子[12]。MC是免疫細胞的一種，可分泌多種細胞因子，參與T細胞、B細胞、APC細胞的活化。研究顯示，MC常分布于腸黏膜下小血管、毛細血管叢，其在炎癥性腸病中顯著提高，并釋放大量顆粒[13]。MC活化釋放多種細胞介質，TA是MC活化、釋放顆粒的特異性標志，UC患者中TA水平顯著增高[14]。另外TA也可激活MC，可刺激MC脫顆粒，放大MC效應，使MC以瀑布效應得到激活。動物實驗證實，向健康小鼠結腸內灌注TA可引發腸道炎癥[15]。本研究顯示，茯苓多糖治療后，大鼠MC數目、脫顆粒率及TA水平均顯著下降，提示茯苓多糖可抑制MC的激活，進而緩解UC病理癥狀。

ST2是IL-1受體家族成員，可分為可溶型ST2(sST2)和跨膜型ST2(ST2L)，主要在Th2細胞、MC、巨噬細胞中表達[16]。研究報道IL-33是ST2的功能配體，炎性腸病患者血清IL-33、ST2水平與疾病的嚴重程度密切相關，是疾病活動程度的標志物[17]。機體胃腸道組織細胞損傷時，IL-33作為組織損傷的信號被凋亡細胞釋放。研究顯示，IL-33在UC及克羅恩病患者血清中異常升高[18]。本研究中，UC大鼠IL-33、ST2水平顯著高于對照組，茯苓多糖治療后，UC大鼠IL-33、ST2水平顯著降低，提示抑制IL-33、ST2水平對緩解UC炎癥反應具有重要作用。UC主要是Th2細胞介導的腸黏膜炎癥，Th2細胞特征性的細胞因子IL-5在UC患者血清中異常增加[19]。IL-5的主要來源是嗜酸性粒細胞，嗜酸性粒細胞又通過分泌IL-5來促進炎癥的發展。IL-13也是Th2細胞介導的關鍵因子，其與細胞凋亡和修復密切相關。IL-33與受體ST2結合對Th2細胞進行調節，進而作用于MC、巨噬細胞、自然殺傷細胞調節免疫反應。IL-33/ST2信號可促進腸黏膜Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-13，加強炎癥反應，促進疾病進程的發展。本研究中，與對照組比較，模型組大鼠MC數目、IL-5、IL-13、IL-6的水平升高，茯苓多糖治療后MC數目、IL-5、IL-13、IL-6的水平顯著降低，提示茯苓多糖可通過IL-33/ST2信號通路抑制MC的激活及炎癥反應。

綜上所述，茯苓多糖能夠通過IL-33/ST2抑制MC的激活進而緩解結腸黏膜損傷及炎癥反應，發揮結腸黏膜保護作用，但關于茯苓多糖調控IL-33/ST2通路的機制有待進一步研究。