miR-127-3p靶向MAPK4對肝癌HepG2細胞株生物學特性的影響①

張玉蓉 賈俊枝 徐國明 郭 紅

(內蒙古醫科大學附屬醫院日間病房，呼和浩特 010050)

肝癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，每年約有63萬新肝癌病例產生[1]。在我國，肝癌患者約占總癌癥病例的50%，其五年存活率約為5%[2]。現階段，對肝癌患者多采用手術切除及放、化療進行治療，但多因再度復發及轉移而預后不良[3]。近年來肝癌發病率逐年遞增，探究肝癌生長及轉移相關的分子機制成為醫學領域研究熱點[4]。miR-127-3p是一類抑癌基因，研究表明，在骨肉瘤中，miR-127-3p可顯著抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[5]；在骨巨細胞瘤中，miR-127-3p可顯著抑制癌細胞集落形成及瘤體形成[6]。而目前在肝癌中還沒有關于miR-127-3p作用機制的報道。本研究通過上調miR-127-3p，對其在肝癌細胞HepG2中的作用及機制進行深入探索，為尋找肝癌的有效治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人正常肝細胞HL-7702、肝癌細胞HepG2購自美國ATCC公司。

1.1.2實驗動物 SPF級BALB/c雄性裸鼠20只，鼠齡5～6周，體質量20～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2017-0005]，飼養于內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心[SYXK(蒙)2014-0003]，晝夜12 h交替，經過滅菌處理的水和飼料自由攝取。本實驗經內蒙古醫科大學醫學倫理委員會審批(IACUC 2014045)，實驗操作遵循3R原則。

1.1.3主要試劑與儀器 DMEM高糖基本培養液(11965-092)、Transwell小室購自美國Corning公司(3379)，胎牛血清FBS購自美國Gibco公司(10100154)，青鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司(P1400)，Trizol購自美國Invitrogen公司(15596026)，反轉錄試劑盒(4374967)、實時定量PCR試劑盒(10928042)、脂質體2000轉染試劑盒(11668019)、熒光素酶檢測試劑盒(16177)、pcDNA 3.1載體(V79020)購自美國Thermo fisher公司，RIPA裂解液(P0013E)、BCA試劑盒(P0012)、Hoechst染色試劑盒(C1017)、Tunel凋亡檢測試劑盒(C1091)購自上海碧云天生物技術研究所，BrdU試劑盒購自瑞士Roche公司(11647229001)，Ki67(sc-23900)、B細胞淋巴瘤/白血病基因Bcl-2(sc-509)、Bcl伴隨蛋白Bax(sc-20067)、血管內皮生長因子VEGF(sc-365578)、基質金屬蛋白酶MMP-9(sc-21733)抗體購自美國Santa Cruz公司，絲裂原活化蛋白激酶MAPK4(ab211501)、cleaved Caspase-3(ab2302)、MAPK活化蛋白激酶MAPKAPK5(ab97332)、磷酸化MAPKAPK5(p-MAPKAPK5)(ab138668)、熱休克蛋白HSPB1(ab5579)、p-HSPB1(ab5594)抗體購自英國Abcam公司，3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH(BM1623)抗體及對應二抗購自美國博士德生物工程有限公司，ABI7700 PCR儀購自美國ABI公司，pGL3 luciferase promoter載體(E1751)、GLO-Max20/20熒光檢測儀購自美國promega公司，熒光顯微鏡、光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組 人正常肝細胞HL-7702及肝癌細胞HepG2(ATCC)以體積分數為15%的FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養液進行培養。培養箱設置為37℃、體積分數5% CO2，傳代次日換液，融合率達到85%以上后再以1×104個/ml 的濃度傳代。肝癌細胞HepG2分為control、miR-127-3p mimic、pcDNA 3.1-MAPK4(pc-MAPK4)及miR-127-3p mimic+pc-MAPK4(mimic+pc-MAPK4)組， miR-127-3p mimic及pc-MAPK4分別或同時轉染細胞6 h，control組加入等量空載，轉染后換正常培養液繼續培養，用于后續檢測。

1.2.2建立HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤模型 裸鼠分為control及miR-127-3p mimic組，每組10只。每只裸鼠皮下接種0.2 ml濃度為1×106個/ml的經或未經miR-127-3p轉染的HepG2細胞。飼養30 d，每隔5 d記錄腫瘤體積V=π/6(腫瘤長徑/2+腫瘤短徑/2)3，然后斷頸處死，收集腫瘤組織并進行石蠟包埋，用于后續檢測。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-127-3p及MAPK4基因表達 將HL-7702、HepG2細胞及1.1.3中移植瘤組織進行總RNA提取。細胞及移植瘤組織中加入Trizol于通風櫥中裂解，依據總RNA提取試劑盒說明書進行抽提，得到的總RNA進行定量分析，取等量RNA反轉錄為cDNA，用實時定量PCR試劑盒配制PCR體系并擴增，得到閾值Δct，以對照組2-Δct平均值為基準1，實驗組2-Δct平均值與對照組2-Δct平均值相比得到的2-ΔΔct為相對變化倍數。

1.2.4熒光素酶實驗 生物信息預測miR-127-3p與MAPK4間連續結合片段，PCR擴增將片段插入熒光素酶報告載體中，構建MAPK4 wt質粒。對兩者間結合片段位點進行突變，構建MAPK4 mut質粒。將miR-127-3p mimic與MAPK4 wt或mut共同轉染HepG2細胞，繼續培養24 h后，檢測細胞熒光素酶活性。

1.2.5BrdU檢測細胞增殖1.2.1中分組細胞以1.5×105個/ml的濃度接種于6孔板中培養24 h，然后加入10 μmol/L BrdU孵育8 h，PBS洗滌。以含體積分數95%乙醇、5%冰乙酸的固定液冰上固定細胞，洗滌后加入BrdU單抗孵育4℃過夜，二抗室溫避光1 h。再用DAPI復染細胞核，熒光顯微鏡觀察并計數。

1.2.6Hoechst染色檢測細胞凋亡 固定1.2.1中分組細胞，洗滌后利用Hoechst染色試劑盒進行染色，操作方法依據Hoechst染色試劑盒說明書，利用熒光顯微鏡進行檢測。激發波長350 nm，發射波長460 nm，可檢測到細胞核呈藍色。

1.2.7Transwell檢測細胞侵襲 4℃預先融化Matrigel，取少量Matrigel到Transwell小室中預包被。接種1.2.1中分組細胞于上室，無血清培養液培養24 h后，棉簽拭去濾膜上層未遷移細胞，HE染色液對遷移下層細胞進行染色并計數。

1.2.8劃痕實驗檢測細胞遷移 先在空白細胞培養板背面畫5～6條穿過板孔且相隔0.5～1 cm的橫線，然后在板中培養1.2.1中分組細胞。細胞鋪滿板孔時進行劃痕，PBS洗滌后用無血清培養液培養24 h。于0和24 h進行拍照并計算劃痕閉合率，劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.9Tunel檢測組織凋亡水平 石蠟切片脫蠟，滴加蛋白酶K修復，放入內源性過氧化物酶封閉液封閉5 min，滴加Tunel檢測液，37℃避光孵育1 h，洗滌后滴加DAB顯色液進行顯色并用蘇木素復染細胞核。凋亡細胞呈棕色，正常細胞為藍色。

1.2.10免疫組化檢測Ki67 石蠟切片脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液修復，滴加一抗至切片4℃孵育過夜，二抗37℃ 1 h，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶蛋白親和素37℃作用40 min，洗滌后避光顯色并用蘇木素復染細胞核。抗原蛋白陽性細胞為棕色，正常細胞為藍色。

1.2.11蛋白質印跡法檢測相關蛋白表達 RIPA裂解液提取1.2.1中分組細胞及1.2.2中移植瘤組織總蛋白，BCA試劑盒進行定量并調平，取蛋白30 μg，質量分數10% SDS-PAGE將其分離，半干轉膜法轉至PVDF膜上，質量分數5%脫脂奶粉2 h室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃ 1 h，最后曝光顯色，GAPDH為內參。

2 結果

2.1miR-127-3p與MAPK4在肝癌HepG2細胞中存在靶向關系 生物信息預測has-miR-127-3p與MAPK4之間存在連續結合片段(圖1A)；與人正常肝細胞HL-7702比較，肝癌HepG2細胞中miR-127-3p表達降低(t=2.661,P=0.007 4)，MAPK4表達升高(t=7.156,P=0.003 1)，其中miR-127-3p相對表達水平為0.37±0.04，MAPK4相對表達水平為2.36±0.27；miR-127-3p mimic可提高HepG2細胞中miR-127-3p表達，其相對表達水平為50.68±12.00(t=9.940,P=0.001 9)，降低MAPK4蛋白水平，其相對蛋白水平為0.17±0.08(t=4.296，P=0.002 2，圖1B)。pc-MAPK4可提高MAPK4蛋白水平，其相對蛋白水平為2.24±0.38，并減弱miR-127-3p mimic對MAPK4抑制作用，其相對蛋白水平為1.16±0.13(t=6.587,P=0.005 5，圖1B)；熒光素酶實驗結果表明，miR-127-3p mimic可降低MAPK4 wt的熒光素酶活性(t=18.805,P<0.001，表1)，以上差異均有統計學意義，而對存在結合位點核苷酸突變的MAPK4 mut，miR-127-3p mimic處理組和未經miR-127-3p mimic處理組相比差異無統計學意義。

2.2miR-127-3p靶向MAPK4對HepG2細胞增殖及凋亡的影響 各組BrdU陽性細胞百分比分別為control組(40.2±4.6)%，miR-127-3p mimic組(9.7±1.2)%，pc-MAPK4組(74.6±8.9)%，mimic+pc-MAPK4組(24.5±4.1)%；各組凋亡細胞百分比分別為control組(6.8±0.9)%，miR-127-3p mimic組(28.3±2.9)%，pc-MAPK4組(2.3±0.5)%，mimic+pc-MAPK4組(11.3±1.4)%。與control組比較，miR-127-3p mimic組中BrdU陽性細胞百分比顯著減少(P=0.004 2，圖2A)，凋亡細胞百分比增多(P=0.005 1，圖2B)，Ki67及Bcl-2蛋白水平降低，Bax及cleaved Caspase-3蛋白水平升高(P=0.006 7，圖2C，表2)；pc-MAPK4組中BrdU陽性細胞百分比增多(P=0.008 8，圖2A)，凋亡細胞百分比減少(P=0.003 9，圖2B)，Ki67及Bcl-2蛋白水平升高，Bax及cleaved Caspase-3蛋白水平降低(P=0.003 6，圖2C，表2)。與miR-127-3p mimic組比較，mimic+pc-MAPK4組中BrdU陽性細胞百分比增多(P=0.004 8，圖2A)，凋亡細胞百分比減少(P=0.006 3，圖2B)，Ki67及Bcl-2蛋白水平升高，Bax及cleaved Caspase-3蛋白水平降低(P=0.007 1，圖2C，表2)，以上差異均有統計學意義。

GroupsControlmiR-127-3p mimicMAPK4 wt4.73±0.421.09±0.22MAPK4 mut4.79±0.434.67±0.48

2.3miR-127-3p靶向MAPK4對HepG2細胞侵襲遷移的影響 各組細胞劃痕愈合率分別為Control組(86.0±9.0)%，miR-127-3p mimic組(51.0±5.0)%，pc-MAPK4組(95.0±9.0)%，mimic+pc-MAPK4組(67.0±6.0)%；各組侵襲細胞數目分別為control組188±15，miR-127-3p mimic組86±11，pc-MAPK4組274±27，mimic+pc-MAPK4組151±19。與control組比較，miR-127-3p mimic組中細胞劃痕閉合率降低(P=0.007 3，圖3A)，侵襲細胞數減少(P=0.005 6，圖3B)，MMP-9及VEGF蛋白水平降低(圖3C，表3)；pc-MAPK4組中細胞劃痕閉合率升高(P=0.008 5，圖3A)，侵襲細胞數增多(P<0.01，

圖2 miR-127-3p mimic及pc-MAPK4對HepG2細胞增殖及凋亡的影響

Fig.2 Effect of miR-127-3p mimic and pc-MAPK4 on proliferation and apoptosis of HepG2

Note： A.Detection of cell proliferation by BrdU(×400);B.Detection of cell apoptosis by Hoeschst(×400);C.Detection of proliferation and apoptosis related protein levels by Western blot.1.Control;2.miR-127-3p mimic;3.pc-MAPK4;4.mimic+pc-MAPK4.

GroupsKi67Bcl-2Baxcleaved Caspase-3miR-127-3p0.21±0.040.29±0.043.45±0.263.46±0.25pc-MAPK42.38±0.222.46±0.240.33±0.040.35±0.04mimic+pc-MAPK40.88±0.080.91±0.091.69±0.141.71±0.13F394.023334.14496.00540.16P<0.001<0.001<0.001<0.001

圖3 miR-127-3p mimic及pc-MAPK4對HepG2細胞侵襲遷移的影響

Fig.3 Effect of miR-127-3p mimic and pc-MAPK4 on invasion and migration of HepG2

Note： A.Detection of cell invasion by Transwell;B.Detection of cell migration by wound healing;C.Detection of MMP-9 and VEGF protein levels by Western blot.1.Control;2.miR-127-3p mimic;3.pc-MAPK4;4.mimic+pc-MAPK4.

GroupsMMP-9VEGFmiR-127-3p mimic0.19±0.040.18±0.04pc-MAPK42.08±0.301.97±0.23mimic+pc-MAPK40.76±0.070.72±0.08F175.32249.17P<0.001<0.001

圖4 miR-127-3p mimic及pc-MAPK4對HepG2細胞中MAPK4下游蛋白的影響Fig.4 Effect of miR-127-3p mimic and pc-MAPK4 on downstream protein of MAPK4 in HepG2Note:n=6；1.Control;2.miR-127-3p mimic;3.pc-MAPK4;4.mimic+pc-MAPK4.

表4 MAPK4下游蛋白水平

Tab.4 Downstream protein levels of MAPK4

Groupsp-MAPKAPK5/MAPKAPK5p-HSPB1/HSPB1miR-127-3p mimic0.32±0.060.28±0.04pc-MAPK42.13±0.201.88±0.18mimic+pc-MAPK40.74±0.090.71±0.08F312.45305.48P<0.001<0.001

圖5 miR-127-3p mimic對HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤的影響Fig.5 Effect of miR-127-3p mimic on subcutaneous transplantation of HepG2 cells in nude miceNote:A.Volumetric growth curve of subcutaneous xenografts in nude mice;B.Appearance of subcutaneous xenograft tumors in nude mice;C.Percentage of Ki67 positive cells detected by immunohistochemistry;D.Tunel detection of tumor cell apoptosis;E.Western blot detection MMP-9 protein level and p-MAPKAPK5/MAPKAPK5 ratio.

圖3B)，MMP-9及VEGF蛋白水平升高(P=0.005 8，圖3C，表3)。與miR-127-3p mimic組比較，mimic+pc-MAPK4組中細胞劃痕閉合率升高(P=0.008 3，圖3A)，侵襲細胞數增多(P=0.007 8，圖3B)，MMP-9及VEGF蛋白水平升高(P=0.006 8，圖3C，表3)，以上差異均有統計學意義。

2.4miR-127-3p靶向MAPK4對HepG2細胞中MAPK4下游蛋白的影響 與control組比較，miR-127-3p mimic組中p-MAPKAPK5/MAPKAPK5及p-HSPB1/HSPB1降低(P=0.007 5)，pc-MAPK4組中p-MAPKAPK5/MAPKAPK5及p-HSPB1/HSPB1升高(P=0.006 8，圖4，表4)。與miR-127-3p mimic組比較，mimic+pc-MAPK4組中p-MAPKAPK5/MAPKA PK5及p-HSPB1/HSPB1升高(P=0.005 5，P=0.005 6，圖4，表4)，以上差異均有統計學意義。

2.5miR-127-3p靶向MAPK4對HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤的影響 與control組比較，miR-127-3p mimic組HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤體積降低，其中control組終體積(2 035±156)mm3，miR-127-3p mimic組終體積(1 089±123)mm3(P=0.007 3，圖5A、B)；同時control組瘤重(2.42±0.20)g，miR-127-3p mimic組瘤重(1.34±0.16)g (P=0.005 5)；miR-127-3p表達升高，MAPK4表達降低，其中miR-127-3p相對表達水平34.85±7.40，MAPK4相對表達水平0.38±0.05(P<0.001)；Ki67陽性細胞百分比減少，其中control組陽性細胞百分比(43.0±5.0)%，miR-127-3p mimic組陽性細胞百分比(9.0±2.0)%(P=0.004 7，圖5C)，凋亡細胞百分比增多，其中control組凋亡百分比(7.0±2.0)%，miR-127-3p mimic組凋亡百分比(49.0±6.0)%(P=0.004 2，圖5D)；MMP-9蛋白水平與p-MAPKAPK5/MAPKAPK5降低，其中MMP-9蛋白水平0.21±0.10，p-MAPKAPK5/MAPKAPK5比值0.22±0.09(P=0.004 7，P=0.003 5，圖5E)，以上差異均有統計學意義。

3 討論

近十年來，miRs逐漸被報道參與了各種生物過程，包括細胞存活、增殖、分化、凋亡及運動[7]。同時，某些miRs還可通過負調控原癌基因作為癌癥的抑制因子[8]， miR-127-3p也是一種腫瘤抑制因子，大量研究報道了miR-127-3p的腫瘤抑制作用[5,6,9]。本文通過生物信息預測發現miR-127-3p與MAPK4存在連續結合片段，預示miR-127-3p與MAPK4間存在靶向關系。MAPK4是MAPK信號通路中的重要一員，其表達上調可顯著提高細胞的增殖能力[10]。本文通過對比正常肝細胞HL-7702發現，肝癌細胞HepG2中miR-127-3p基因表達顯著降低，MAPK4蛋白水平顯著升高，提示miR-127-3p下調及MAPK4上調與肝癌發生有關；利用miR-127-3p mimic上調miR-127-3p后，MAPK4蛋白水平顯著下降，提示miR-127-3p對MAPK4有潛在調控作用；同時熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-127-3p mimic可顯著降低MAPK4 wt熒光素酶活性，而對MAPK4 mut沒有顯著影響。綜合上述實驗結果提示，在HepG2細胞中，miR-127-3p可靶向下調MAPK4表達。

降低癌細胞增殖能力可有效阻止癌癥發生及其進一步惡化。據報道miR-127-3p不僅可降低癌細胞增殖能力，還可顯著誘導細胞凋亡的發生，如miR-127-3p可通過負調控其靶基因細胞色素C氧化酶同源組裝因子COA1顯著降低骨巨細胞瘤細胞增殖能力并阻止瘤體形成[6]；通過負調控賴氨酸甲基轉移酶SETD8及整合素亞基-α 6顯著抑制骨肉瘤細胞增殖并提高Caspase-3活性[5,11]。Caspase-3是執行細胞凋亡程序的關鍵蛋白，其活性增強預示著凋亡水平的提高[12]。本研究發現，在HepG2細胞中，上調miR-127-3p后，可通過靶向下調MAPK4顯著減少BrdU陽性細胞百分比及Ki67、Bcl-2表達，增加凋亡細胞百分比及Bax、cleaved Caspase-3表達，而過表達MAPK4可顯著增加BrdU陽性細胞百分比及Ki67、Bcl-2表達，減少凋亡細胞百分比及Bax、cleaved Caspase-3表達，并減弱miR-127-3p產生的抑增殖促凋亡作用。Ki67是細胞增殖相關蛋白，其表達水平可用于評估細胞的增殖能力[13]。Bcl-2是凋亡研究中最受重視的癌基因，可顯著抑制細胞凋亡的發生[14]，而Bax是一類促凋亡蛋白，通過調節線粒體通透性及凋亡誘導因子活性提高細胞凋亡水平[15]。cleaved Caspase-3是Caspase-3的活化形式，可作為檢測細胞凋亡水平的經典指標[16]。同時，在本文中，miR-127-3p可通過靶向下調MAPK4顯著減小HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤體積，減少組織中Ki67陽性細胞百分比并增加凋亡細胞百分比。綜合實驗結果說明，miR-127-3p可通過靶向下調MAPK4顯著抑制HepG2細胞生長并促進其凋亡的發生。

易復發易轉移是現階段肝癌治療后出現預后不良的主要原因，控制癌細胞侵襲及遷移可降低癌組織的轉移概率[3]。研究表明，miR-127具有強烈的抗侵襲遷移作用，可通過下調其靶基因的表達顯著抑制胰腺癌、骨肉瘤、食管鱗狀細胞癌及骨巨細胞瘤細胞侵襲及遷移[17-20]，而miR-127表達下調對乳腺癌組織生長轉移有顯著促進作用[21]。同時，作為miR-127的穩定表型，報道表明miR-127-3p可通過靶向作用顯著降低骨肉瘤及骨巨細胞瘤細胞的侵襲及遷移能力[5,6]。在本研究中，上調miR-127-3p不僅可減少HepG2侵襲細胞數、劃痕閉合率及MMP-9、VEGF表達，還可降低HepG2裸鼠皮下移植瘤組織中MMP-9蛋白水平。而過表達MAPK4可顯著提高HepG2細胞在體內及體外的侵襲及遷移能力，并減弱miR-127-3p產生的抗侵襲遷移作用。MMP-9是金屬基質蛋白酶家族的一員，具有降解細胞外基質的能力，其表達量增加能顯著促進癌細胞的侵襲遷移[22,23]。VEGF是血管內皮生長因子，參與癌組織新生血管和新生淋巴管的形成[24]。綜合實驗結果說明，miR-127-3p可通過靶向下調MAPK4顯著抑制HepG2細胞侵襲遷移。絲裂原活化蛋白激酶MAPK4是MAPK-活化蛋白激酶MAPKAPK5的主要調節因子之一，MAPK4可直接激活MAPKAPK5，沉默MAPK4可導致MAPKAPK5活性發生顯著降低[25]。研究表明，MAPKAPK5在肝癌細胞中被顯著激活，并抑制cleaved Caspase-3及DNA修復酶PARP蛋白表達，從而顯著降低癌細胞凋亡水平并促進細胞存活[26]。在本研究中，miR-127-3p可通過靶向下調MAPK4顯著降低其下游蛋白MAPKAPK5及HSPB1在HepG2細胞中的磷酸化比值。HSPB1是MAPKAPK5的直接作用底物，在體內主要發揮細胞保護的功能，臨床檢測發現，HSPB1磷酸化比值與肝癌患者腫瘤直徑及其門靜脈侵襲率呈正比[27]。提示HSPB1與癌癥發展有著密切聯系，miR-127-3p可能通過此通路對HepG2細胞生長轉移產生抑制作用。

綜上所述，miR-127-3p可通過靶向下調MAPK4顯著抑制肝癌細胞HepG2在體內及體外增殖、侵襲、遷移并促進其凋亡的發生。同時，miR-127-3p還可通過靶向下調MAPK4抑制其下游蛋白MAPKAPK5及HSPB1磷酸化，提示miR-127-3p可能通過此通路阻礙HepG2細胞生長轉移，為miR-127-3p用于肝癌臨床治療提供理論依據。