超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間高分辨質譜用于太平洋鱈魚脂質輪廓分析

藍皓慧 王昕岑 張曉梅 張鴻偉 叢培旭 徐杰 薛長湖

摘要建立了超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間高分辨質譜（UPLCTriple TOFMS/MS）分析脂質輪廓的方法。 色譜柱選用ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm× 2.1 mm， 1.7 μm），流動相A為乙腈水（65∶35， V/V），流動相B為異丙醇乙腈（85∶15， V/V），兩者均含5 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸;質譜采用IDA自動二級掃描模式。13類脂質標準品在一定濃度范圍內具有良好的線性關系，線性相關系數（R2）均大于0.995，檢出限（LOD）為0.001～0.25 μmol/L，定量限（LOQ）為0.0025～0.2 μmol/L，相對標準偏差（RSD）均小于10%，大部分標準品的回收率大于80%。采用氯仿甲醇（2∶1，V/V）提取太平洋鱈魚肌肉組織中的脂質，共鑒定出498個脂質分子種類，包括255個磷脂、52個鞘脂、191個甘油酯，主要亞類分別為磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、甘油二酯。本方法具有高靈敏、高分辨和高通量等優點，可用于太平洋鱈魚脂質輪廓的分析，為脂質組學在水產品領域中的應用奠定了方法學基礎。

關鍵詞脂質輪廓; 超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間高分辨質譜; 磷脂; 鞘脂; 太平洋鱈魚

1引 言

脂質組學是代謝組學的一個分支，是對脂質進行系統分析的一門學科，主要研究內容為脂質及其代謝物的分析鑒定、脂質的生物功能與代謝調控、脂質的代謝途徑及網絡等[1]。自2003年被提出后[2]，脂質組學得到了快速發展，在結腸癌[3]、肝癌[4]等多種癌癥的臨床早期預防和篩查、代謝疾病的檢測[5，6]、脂質生物標志物的發現[7]和藥物靶點的鑒定[8]等研究中發揮了重要作用。近年來，脂質組學被逐漸應用于食品領域，為食品組分的脂質分析提供了快速、準確、高通量的方法[9，10]，同時也為食品摻假分析和溯源追蹤提供了新的研究思路。張耀利等[11]建立了基于大氣壓化學電離質譜快速分析食用油中甘油三酯的方法，發現了泔水油和煎炸油的差異。Li等[12]采用超高液相色譜串聯四極桿靜電場軌道阱質譜分析羊奶、豆奶、牛奶的脂質組成，篩選出可作為牛奶類型區分的14種脂質標志物，為奶類鑒定和摻假分析提供了依據。

由于食品脂質組學發展較晚，水產品中脂質種類和結構復雜，因此，關于水產品脂質組學的研究還處于初期階段。Chen等[13]采用“鳥槍法”脂質組學技術對牡蠣中的磷脂進行了分析，其中包括29種磷脂酰膽堿、23種磷脂酰乙醇胺、11種磷脂酰絲氨酸、6種磷脂酰肌醇和17種溶血型磷脂。“鳥槍法”脂質組學技術通常采用直接進樣，大大縮短了分析時間，但難以分析低豐度的脂質。Song等[14]建立了快速蒸發電離質譜（REIMS）鑒別鮭魚和虹鱒魚脂質的方法，共鑒定出12種脂肪酸和37種磷脂分子，用于鮭魚產品真實性的判斷依據。盡管REIMS技術在食品真偽及質量快速檢測領域具有較好的應用前景，但其主要應用于定性分析，而難以用于定量分析。叢培旭等[15]建立了高效液相色譜串聯三重四極桿質譜（HPLCQQQMS/MS）定量檢測海參和海膽中單唾液酸神經節苷脂的分析方法，HPLCQQQMS/MS比較適合脂質成分的定量分析，但其分辨率較低，易受相近m/z的離子干擾。超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間高分辨質譜（UPLCTriple TOFMS/MS）具有高通量、高分辨率、高速等優點，通過一次進樣即可實現對多種脂質分子準確地定性和定量分析[16]。

太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus），又名為大頭魚，為生活在海洋底層的冷水性魚類，廣泛分布于中國的黃海和渤海地區[17]， 肉質鮮美，營養價值高，是重要的經濟魚類之一[18]。然而，有關太平洋鱈魚脂質的研究報道較少。本研究采用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間高分辨質譜（UPLCTriple TOFMS/MS）建立了水產品脂質輪廓分析方法，對流動相中甲酸銨濃度和質譜碰撞能進行了優化， 用于太平洋鱈魚的脂質種類及含量分析和營養價值評價。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Nexera UHPLC LC30A超高效液相色譜系統（日本島津公司）; TripleTOF 5600高分辨質譜儀和Analyst 1.6.3、PeakView 2.2、MultiQuant 3.0數據處理軟件（美國AB Sciex公司）; ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）; Hypersil GOLD柱（150 mm×4.6 mm， 3 μm，美國Thermo Scientific公司）; MilliQ超純水系統（美國Millipore公司）; DUC1C氮吹儀（日本Taitex公司）; CP1MX高速冷凍離心機（日本Hitachi公司）。

氯仿、甲醇、異丙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）; 氯仿、甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純，美國Thermo Fisher公司）; 甲酸、甲酸銨（色譜純，美國SigmaAldrich公司）; 脂質標準品： 溶血磷脂酰膽堿LPC （19∶0）、磷脂酰膽堿PC （14∶0/14∶0）、溶血磷脂酰乙醇胺LPE （14∶0）、磷脂酰乙醇胺PE （14∶0/14∶0）、磷脂酰絲氨酸PS （14∶0/14∶0）、磷脂酰甘油PG （14∶0/14∶0）、磷脂酸PA （14∶0/14∶0）、磷脂酰肌醇PI（混標）、鞘磷脂SM （d18∶1/12∶0）、神經酰胺Cer （d18∶1/17∶0）、腦苷脂GalCer （d18∶1/12∶0）、甘油二酯DAG （17∶0/17∶0）、甘油三酯TAG （17∶0/17∶0/17∶0）（美國Avanti Polar Lipids公司）。

2.2標準溶液的配制

2.3LCMS/MS分析

2.3.1色譜條件色譜柱： ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm×2.1 mm， 1.7 μm）; 柱溫： 50℃; 自動進樣器溫度： 4℃; 流動相A為乙腈水（65∶35， V/V），流動相B為異丙醇乙腈（85∶15， V/V），兩者均含5 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸。梯度洗脫： 0～2 min，85%～70% A; 2～3 min，70%～60% A; 3～15 min，60%～25% A; 15～20 min，25%～1% A; 20～25 min，1% A; 25～26 min，1%～85% A; 26～30 min，85% A。流速： 0.35 mL/min。

2.3.2質譜條件電離模式： ESI+和ESI-（各脂質的電離模式見表2）; 噴霧電壓（ISVF）： ±5500 V; 離子化溫度（TEM）： 500℃; 霧化氣（GS1）： 50 psi（1psi=6.89 kPa），輔助加熱（GS2）： 50 psi; 氣簾氣（CUR）： 35 psi; 掃描范圍： m/z 150～1200; IDA自動二級掃描模式; 碰撞能： 45 eV; 進樣量： 5 μL。

2.4樣品處理

采用Folch法提取樣品脂質[19]。取0.5 g粉碎的魚肌肉組織，置于具塞離心管中，重復做6個平行，分別加入9 mL氯仿甲醇（2∶1， V/V），冰浴下均質，振蕩提取10 min，再加入3 mL超純水，渦旋1 min，4℃下5000 g離心10 min，收集下層溶液，上層水相再加入9 mL氯仿甲醇（2∶1， V/V）重新提取，合并下層溶液。40℃下，N2吹至干得到總脂，用1 mL異丙醇乙腈（2∶1， V/V）復溶， 過0.22 μm有機濾膜后，Symbolm@@20℃保存，待測。

2.5數據處理

將質譜采集數據導入LipidView進行非靶向定性分析，在脂質數據庫中搜索母離子和子離子碎片信息，分析結果輸出后，導入PeakView進行靶向定性分析，查看每個脂質分子種的色譜、一級和二級質譜信息，確定分子種組成、保留時間和特定碎裂行為，手動過濾假陽性結果。脂質定性結果直接導入MultiQuant進行定量分析，最終獲得準確的脂質含量信息。

3結果與討論

3.1色譜條件的優化

3.1.1色譜柱的選擇選擇Hypersil GOLD柱（150 mm×4.6 mm， 3 μm）和ACQUITY UPLC CSH C18柱（150 mm×2.1 mm， 1.7 μm）兩種色譜柱，采用表1中C3的標準品混合液，考察各類脂質標準品提取離子流色譜的保留時間、峰強度和峰寬，結果見表3。ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱利用橋式亞乙基雜化顆粒技術控制顆粒表面電荷數量，為小分子化合物分析提供良好的峰形和柱效，所以大部分脂質的峰寬在0.3 min內，相比于Hypersil GOLD色譜柱，色譜峰的峰形和響應值均更佳。此外，ACQUITY UPLC CSH C18柱可在30 min內完成所有脂質成分的洗脫和分離，更適合快速高通量分析。因此，選用ACQUITY UPLC CSH C18柱（2.1 mm×150 mm， 1.7 μm）作為分析柱。

3.1.2流動相中甲酸銨濃度的優化通過改變流動相中甲酸銨的濃度（0、5和10 mmol/L），采用表1中C3的標準品混合液，考察各類脂質標準品提取離子流色譜峰峰寬和峰強度，確定最優的甲酸銨濃度。結果表明，甲酸銨濃度對部分磷脂的峰形有很大影響，PI、PG和PS的峰形在一定程度上得到了改善，

3.2質譜條件的優化

設定碰撞能（CE）分別為30、45和60 eV，對標準混合液進行分析，確定最優CE。結果表明，當CE=45 eV，CES=15 eV時，能夠獲得清晰的特征碎片信息，可得到滿意的質譜結果。

3.3脂質結構鑒定

不同類別的脂質化合物在二級質譜中具有特征裂解規律，在不同的化學鍵位點斷裂而產生特異性產物離子或中性丟失碎片離子，13類脂質的碎片離子見表2。根據各類脂質裂解規律，鑒定脂質組分的結構。以PE （16∶0/20∶5）和DG （18∶4/20∶5）兩種脂質分子為例，在負離子模式下，PE （16∶0/20∶5）形成分子量為736.4958的[M-H]準分子離子，m/z 140.0137和196.0397為PE的特征子離子，m/z 255.2346和301.2191分別是斷裂的C18∶4和C20∶5脂肪酸失去一個氫原子產生的碎片離子（圖2A）。在正離子模式下，DG （18∶4/20∶5）與流動相中的NH+4結合，形成分子量為652.4943的[M+NH4]+， m/z 333.2410和359.2558分別是酯鍵斷裂后丟失C20∶5和C18∶4脂肪酸產生的碎片離子（圖2B）。

3.4方法學驗證

3.4.1線性范圍按表1中混合標準溶液濃度從低到高（C8～C0）順序依次進樣，每個濃度重復進樣3次，以各類脂質分子的峰面積平均值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。各類脂質對應的線性方程、相關系數（R2）、線性范圍見表4，在一定濃度范圍內，回歸系數均大于0.995，表明線性關系良好。

3.4.2靈敏度將表1混合標準溶液濃度從低到高（C8～C0）依次進樣，以信噪比S/N=3時的濃度為檢出限（LOD）， S/N=10時的濃度為定量限（LOQ）。各類脂質的檢出限和定量限見表4。由于拖尾問題影響色譜峰形，PA檢測靈敏度略低，除PA外，其它脂質均有較高的檢測靈敏度。

3.4.3精密度和回收率分別在0.5 g魚肉組織中加入表1中C3濃度水平的標準溶液，按照2.4節進行樣品處理，記作樣本1; 不加魚肉組織進行同樣處理，記作樣本2; 加入魚肉組織，不加標準品，進行相同處理，記作樣本3。樣本1按照方法分析6次，用相對標準偏差（RSD）評價精密度。分別測定樣本1、2、3，測得峰面積，并按照公式（1）計算回收率（R，%）：

R（%）=（ATest-ASample）AStandard×100%（1）

方法的精密度和回收率見表4。13類脂質的精密度均小于10%，且大部分脂質的回收率都高于80%，表明方法的精密度和回收率良好。

3.5方法應用

利用上述優化的實驗方法，對太平洋鱈魚的脂質輪廓進行分析，通過外標標準曲線法對樣品中的各類脂質進行定量分析。圖3A和B為太平洋鱈魚脂質提取物的正負離子總離子流圖，各類脂質的保留時間見表5。在太平洋鱈魚中共鑒定出498個脂質分子種類，包括255個磷脂、52個鞘脂、191個甘油酯（表5）。根據定量分析結果計算出鱈魚中各類脂質百分含量（圖4）。結果表明，鱈魚中的脂質主要為甘油酯和磷脂; DAG是甘油酯的主要成分，占總脂質47.3%; PE為鱈魚磷脂的最主要成分，占總脂質13.0%; 鞘脂中SM含量最高，占總脂質2.4%。

分析結果表明，太平洋鱈魚中磷脂占總脂質的34.0%，且含有7種不同的磷脂亞類，PC和PE為主要的磷脂亞類，二十碳五烯酸（EPA，C20∶5）和二十二碳六烯酸（DHA，C22∶6）是磷脂中主要的脂肪酸（圖3C）。已有研究表明，海水魚與淡水魚的脂肪酸組成不同，海水魚中DHA和EPA的比例最高[20]，而淡水魚中花生四烯酸（AA，C20∶4）和二十二碳五烯酸（DPA，C22∶5）的比例較高; 海水魚磷脂中DHA和EPA的含量比山羊奶、豆奶和牛奶中高得多[11]。因此，太平洋鱈魚磷脂種類豐富、含量高，且富含DHA和EPA，是磷脂的良好來源。

對鞘脂分析發現，SM、Cer和腦苷酯（HexCer）是太平洋鱈魚的鞘脂成分，其中SM和Cer是其主要成分。由圖3D可知，d19∶3為Cer中含量最高的長鏈堿（LCB），其次是d18∶1，d19∶3在哺乳動物中比較罕見[12]。鞘脂在調節細胞生長到細胞死亡和衰老等多種生物過程中發揮著重要作用[21]，近年來， 鞘脂生物活性的研究報道逐漸增加，而對魚類脂質的研究主要集中在多不飽和脂肪酸（PUFA）、磷脂和甘油酯方面[22]。因此，本研究對鞘脂進行了分析，有助于深入了解太平洋鱈魚的脂質代謝和營養價值。

4結 論

建立了基于UPLCTriple TOFMS/MS脂質輪廓分析方法。方法線性范圍寬，靈敏度、精密度和回收率均較高，滿足脂質組學高通量定性和高準確度定量分析的要求。對太平洋鱈魚脂質分子種類和含量進行了全面系統的研究，單次進樣即可鑒定出498種脂質分子，包括255種磷脂、52種鞘脂、191種甘油酯。本研究分析的眾多脂質分子種類可為鱈魚營養價值研究提供可靠的依據，所建立的分析方法將為水產品脂質組學提供方法學支持，為脂質組學在水產品科學中的應用奠定基礎。

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