微藻細胞破壁方法研究進展

劉俊果　董堯坤　張園園

摘 要：微藻具有光合作用效率高、環境適應性強、生長快、生物質產率高和環境效益顯著等優點，在體內還能積累蝦青素、葉黃素、高不飽和脂肪酸、生物柴油等重要產物，近年來成為人們關注和研究的熱點。微藻細胞破壁是提取這些產物的關鍵及困難環節。從3種常用微藻細胞壁的結構入手，分析總結了機械破壁法、基于波的細胞破壁法、熱解破壁法、化學法以及生物法等微藻破壁技術的研究現狀與發展趨勢。認為從現實角度出發，將化學法與機械法結合使用，即先采用化學法進行預處理，再采用機械法破壁，可解決大部分藻細胞的破壁問題，是一種比較可行的產業化破壁技術路線;從發展前景來看，生物法破壁具有能量消耗較低、條件溫和等優勢，對于絕大多數藻類來說具有經濟可行性和技術理論可行性，是一種最值得期待的破壁方法。

關鍵詞：生物工程其他學科;微藻;細胞破壁;機械法;非機械法

中圖分類號：O949.2 文獻標識碼：A

doi：10.7535/hbkd.2020yx03008

Advances in microalgae cell wall disruption

LIU Junguo， DONG Yaokun， ZHANG Yuanyuan

（School of Bioscience and Bioengineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China）

Abstract：

Microalgae cultivation shows the advantages of high photosynthesis efficiency， good environmental adaptability， fast growth， high bioproducts productivity and good environmental value， and many valuable products including astaxanthin， lutein， high-unsaturated fatty acids， lipids， etc. can accumulate in microalgae cells， so microalgae has become the focus in scientific research in recent years. Cell disruption is the key and difficult step to extract those products. Starting from discussing the cell wall structural characteristics of three species of microalgae， the current situation， trends in scientific research and technical development of cell disruption strategies including mechanical， wave-based， pyrolysis， chemical and biological methods were discussed and summarized. It is pointed out that practically the combination of chemical and mechanical methods， with chemical procedures as pretreatment and mechanical step as final disruption， can solve cell disruption problems for most microalga， and is a more feasible cell disruption industrialization technology. Prospectively， biological method is feasible economically and theoretically for most microalga because of its low energy cost and mild process conditions， and tends to be a deservable method.

Keywords：

other subjects in bioengineering; microalgae; cell wall disruption; mechanical cell lysis; non-mechanical cell lysis

微藻是一類在陸地、海洋廣泛分布的自養單細胞生物，具有光合作用效率高、環境適應性強、生長快、周期短、占地面積小、生物質產率高和環境效益顯著等特點[1]。近年來，利用微藻生產蝦青素、葉黃素、藻膽蛋白（藻紅蛋白、藻藍蛋白和變藻藍蛋白）、高不飽和脂肪酸、生物柴油的研究與技術開發，受到人們的普遍關注。從

2015—2019年的5年內，圍繞微藻發表的CNKI論文有2 306篇，申請中國發明專利1 591項。微藻在食品、醫藥保健、基因工程、液體燃料等領域具有很好的開發前景。

盡管微藻存在很多優勢，但大規模應用仍面臨很多問題。微藻中這些令人類感興趣的物質大多存在于細胞內，這些物質的提取過程通常需要先對微藻進行細胞破壁。與一般微生物細胞壁相比，微藻細胞壁結構致密，破壁難度大，同時還要保證各種生化產物在破壁過程中的生物活性不被破壞，因此細胞破壁成為各種藻類產物提取的關鍵環節[2]。本文就此進行總結，討論了微藻破壁技術的研究現狀與發展趨勢，為相關研究提供理論參考和實踐依據。

1 微藻細胞壁的結構特點

討論微藻細胞的破壁技術，有必要先研究微藻細胞壁的結構特點。本文主要對最受關注的3大類微藻進行討論。

1.1 雨生紅球藻（Haematococcuspluvialis）

雨生紅球藻因為能在體內大量積累蝦青素和不飽和脂肪酸而廣受關注，其細胞壁因生長階段和生長環境的變化而變化。當營養條件充分時，雨生紅球藻外形近球形，綠色，帶鞭毛，富有運動性;當營養條件不良時，其顏色逐漸由綠色轉變為紅色，并且伴隨著蝦青素的不斷積累，雨生紅球藻由游離狀態變為不動孢子聚合體狀態，鞭毛喪失，運動性喪失，呈休眠狀態，細胞壁變得厚而致密[3-4]。此不動孢子聚合體細胞壁干重占整個細胞干重的16%，成分如下：糖類70%（其中甘露糖占89.4%、葡萄糖6.4%、阿拉伯糖1.6%、木糖1.3%），纖維素3%，蛋白質6%[3]。

生產花青素過程中需要破壁的雨生紅球藻細胞是結構最致密的不動孢子聚集體。處于不動孢子聚集體狀態的細胞壁分為2層：外層是耐酸的algaenan（膠鞘），厚度30～40 nm;內層是甘露糖和纖維素，厚度400～700 nm。膠鞘是一種不易水解的疏水脂肪族生物大分子，分子質量為400～2 000 Da，由飽和26C和28C脂肪酸與飽和30C或32C的醇或脂肪酸縮合成酯，結構式如圖1所示[5]。這種細胞壁結構在微球藻屬中屬于常見結構。

1.2 小球藻（也稱綠藻，Chlorella spp.）

近幾年小球藻屬在單細胞蛋白的生產、生物能源等領域一直是研發熱點。小球藻細胞直徑2～10 μm，無鞭毛，似親孢子無性繁殖，18～24 h繁殖一代。新生子細胞細胞壁最薄，只有幾納米，而含有目的產物的大多屬于成熟細胞，細胞壁厚達20～25 nm。成熟細胞細胞壁分為內外2層：外層為耐酸的膠鞘，與雨生紅球藻一樣，內層為類幾丁質[2]。

NORTHCOTE等[6]針對蛋白核小球藻的研究表明，藻細胞直徑3～4 μm，細胞壁厚度21 nm，占細胞總干重的13.6%。細胞壁中蛋白質含量約占27%，脂類9.2%，alpha-纖維素15.4%，半纖維素31.0%，葡萄糖胺3.3%，灰分5.2%。其中：alpha-纖維素由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖和鼠李糖構成;葡萄糖胺組分可以溶于稀堿溶液中，因此細胞壁中可能不含有幾丁質。電子顯微鏡研究結果表明，細胞壁結構類似于植物細胞的初生細胞壁結構。纖維束直徑為3～5 nm，分2個方向不規則地連續交織在一起，細胞壁的內側和外側結構上沒有明顯差別，細胞壁中不含有木質素。

小球藻細胞壁成分受培養條件的影響很大。比如二氧化碳濃度升高時，會導致細胞壁糖醛酸和氨基糖含量升高，而中性糖組分降低[4]。而在高鹽培養基中，小球藻細胞壁的厚度會增加70%[7]。

1.3 微綠球藻（Nannochloropsis spp.）

因含有大量不飽和脂肪酸，微綠球藻在營養保健及生物能源領域倍受重視。SCHOLZ等[8]利用電鏡、傅里葉變換紅外光譜等技術，研究了指數生長期的微綠球藻細胞，發現其細胞壁由內外2層構成，內層含有75%（質量分數）的纖維素，外層疏水性，以膠鞘為主成分。ARNOLD等[9]的研究也證實了這一點。BEACHAM等[10]研究了6種微綠球藻的細胞壁結構，發現這6種微綠球藻細胞（指數生長期中期）的細胞壁厚度范圍在63～119 nm，而鹽水微綠球藻（Nannochloropsissalina）細胞壁最薄，易于破壁，也最適用于生產生物柴油。

2 微藻細胞破壁技術

2.1 機械法破壁

2.1.1 高壓均質機法破壁

KWAK等[11]研究了一種新的提取方法，利用高剪切應力混合，造成細胞破碎從而使油脂直接從濃縮濕生物質（>350 g/L）中提取出來。用高剪切混合器（HSM）從海洋微藻（Aurantiochytrium sp.）中提取油脂。結果表明：HSM能顯著提高油脂的產率，且有效消除阻止溶劑分子穿過細胞膜的水屏障，其與正己烷、異丙醇和乙醇的配合使用效率更高?？梢钥闯?，HSM能夠提供一種強大的機械手段，用非極性和毒性較小的溶劑從濕生物質中提取脂質。

OLMSTEAD等[12]的研究表明，高壓均質機法適用于高濃度（20%～25%，質量分數）的微藻料液。800 MPa壓力，均質10次，小球藻的油脂提取率約達到90%。魯龍等[13]研究了高壓勻質法破碎小球藻細胞，得到最佳工藝為：藻液質量濃度為140 g/L，勻質壓力為94 MPa，勻質時間為14 min （均質3-4次）。在此條件下小球藻的油脂得率大約為52%。

由于微藻細胞壁結構致密，高壓均質機法破壁受到重視。高壓均質機的破碎機理主要是高速撞擊、水力空化及強剪切作用[14]。均質破壁的能耗取決于細胞濃度、藻細胞的種類和培養條件，一般1 kg干細胞破壁能耗為0.25 （干細胞濃度1%，氮缺乏培養基培養的細胞） ～147 kW·h （干細胞濃度0.85%，普通培養基培養的細胞）[15]。

高壓均質機法適合于大規模生產，破碎效率高，但是能耗高，設備費用較高，因此限制了其應用。

2.1.2 珠磨法

TALEB等[16]采用英國Constant systems 公司生產的高壓珠磨機破碎微綠球藻

，操作壓力為175 MPa時，細胞破碎率達98%，主要缺陷是能耗高。 PAN等[18]研究了一種改進型渦輪式攪拌珠磨機破碎微擬球藻細胞，得到最佳條件是攪拌切線速度2.3 m/s、藻細胞濃度15%、破碎時間40 min，細胞的破碎率可達到98%以上。POSTMA的研究證實，增加處理時間、切線速度（5～10 m/s）和磨珠用量（不超過磨腔容積的85%）有利于提高細胞破碎率，采用半連續工藝破碎的能耗是1 kg干細胞81 KWh[18]。ZINKON[19]針對珠磨法對微藻連續破壁的過程進行了數學模擬，優化后的工藝條件是玻璃珠直徑0.4 mm， 攪拌槳切線速度14 m/s。此條件下，較大細胞的破碎速度比較小細胞的破碎速度快。POSTMA等[20]研究了珠磨法中玻璃珠直徑對3種微藻普通小球藻（Chlorella vulgaris）、富油新綠藻（Neochlorisoleoabundans）和四肩突四鞭藻（Tetraselmissuecica）破壁效果的影響。發現直徑小利于提高破壁速率，0.3 mm的玻璃珠比能耗最小;直徑0.3～0.4 mm的玻璃珠，破壁效果好，能耗低。珠磨過程沒有破壞Rubisco（核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶）標識蛋白的結構，說明珠磨法比較溫和。GARCIA等[21]采用建模方法研究了珠磨法對微藻的破碎過程，目的在于預測2種微藻在不同玻璃珠大小和用量，以及在2種不同的珠粒研磨機鱗片上的破碎速率。所得數學模型可以支持過程開發、優化和放大研究，并且可以優化操作條件，實現低能耗、高選擇性、溫和的藻細胞破碎工藝。

SAFI 等[22]針對微綠球藻研究了高壓均質機、珠磨機、脈沖高壓電場和酶法4種破壁方法的破壁效果，發現高壓均質機和珠磨機效果最好，破壁率在95%以上，酶法破壁率最小。

珠磨法設備成熟，便于控溫，易于放大，勞動強度低，是規模化破壁常考慮的方法。其主要缺陷是磨珠之間以及磨珠與容器壁之間的機械摩擦造成能量損失，并影響生物產物的活性。磨珠可以選用玻璃、不銹鋼或陶瓷材料，最佳直徑為0.5 mm，直徑增加或減小都會使破碎效率下降。高黏度的料液使用高密度的磨珠（比如氧化鋯）效果更好，而低黏度的料液使用低密度的磨珠（比如玻璃）效果更好[23]。

2.1.3 水力空穴法

水力空穴法的基本原理是流體在流過文丘里管、多孔板等裝置時，會出現湍動，造成局部靜壓下降。當某點靜壓低于液體所在溫度下的空氣分離壓時，原來溶于液體中的氣體會分離出來，產生氣泡（100 nm～3 mm），這就叫空穴現象。當流體流速恢復靜壓時，空穴會塌陷，空穴周圍伴隨產生強烈的沖擊波，瞬間局部壓力可達10.13～506.62 MPa（100～5 000 atm），局部溫度可達500～1 500 K，對周圍流體中存在的細胞、脂肪微粒等顆粒產生強烈的剪切作用，導致其破碎[24]。

LEE 等[25]研究了水力空穴法破碎微藻細胞。與超聲波技術相比，在消耗同樣能量前提下（500～10 000 KJ/kg），水力空穴法的油脂收率為25.9%～99.0%，遠高于超聲波技術（16.2%～66.5%）。

劉明磊等[26]將多孔板、文丘里管及尾渦空化等技術融為一體，結合Fluent數值模擬軟件，設計了一套水力空化細胞破壁循環裝置，并進行了細胞破壁處理。數值模擬結果表明：對于多孔板，減小孔徑、增加孔板厚度和孔數，空化強度增強;圓形交錯的孔分布方式空化效果要優于圓形陣列分布。對于文丘里管，尖角過渡型的文丘里管空化效果最佳;喉部直徑增加，文丘里管的空化效果減弱，但對空泡開始潰滅的位置無影響;漸縮段長度的變化對空化效果影響不大，但對空泡開始潰滅的位置有較明顯的影響;增加漸擴段長度和減小管道直徑使得空化效果加強，空泡開始潰滅的位置離喉部變遠。利用水力空化裝置對微擬綠球藻進行破壁處理試驗，試驗結果表明：對于不同細胞密度的微藻懸濁液，處理時間達到30 min，破壁率均可達到90%以上，但隨著細胞密度的提高，破壁效果下降;入口壓力由0.1 MPa提高到0.25 MPa，細胞破壁率提高約30%;空化器轉速由0增加到1 200 r/min，破壁率提高約20%;與超聲空化相比，水力空化法破壁更充分、更均勻，且處理量遠高于超聲空化。

WAGHMARE等[27]對超聲波法和水力空化法的操作參數和各種預處理進行了優化，以獲得最高的細胞破碎效能。研究表明，超聲破碎的最佳條件是：固體負荷1%、占空比80%、功率輸入54 W、時間為90 min。采用0.5%氫氧化鈉預處理后，用超聲法細胞破裂所需的時間減少到50 min。文丘里管空化裝置，時間為180 min，壓力為0.5 MPa和藻細胞濃度為0.45%。用0.5%氫氧化鈉預處理后，用水力空化法進行最大細胞破碎所需時間減少到105 min。此外，計算了使用超聲法和水力空化法細胞破碎所需的能量，發現水力空化法對于微藻細胞破碎有著更顯著的能量效率。

水力空穴法具有能量消耗低、易于放大、破碎效果好的特點。作為一種破壁新技術，易于放大，適合于大規模生產，破壁效果好，能耗比珠磨法和高壓均質法低，值得大力推廣應用。

2.2 基于波（能量場）的細胞破壁

2.2.1 超聲波破壁

劉明磊等[26]針對超聲空化法開展了小球藻細胞破壁試驗。研究結果表明，各因素對油脂提取率的影響程度的大小順序為：功率>細胞密度>藻液量>時間>溫度>分散劑濃度。綜合考慮對油脂提取率和能量消耗的影響，試驗最優的參數組合為：超聲功率 220 W、溫度 25 ℃、處理時間6 min、細胞質量密度0.2 g/mL、處理量120 mL、分散劑質量濃度0.4 g/mL。WANG等[28]的研究表明，藻細胞依賴鈣離子或三價鋁離子絮凝形成絮體后，超聲破壁的效果會下降。為了減少超聲波破壁過程中所消耗的能量，常配合使用化學法破壁，即預先向料液中添加酸、表面活性劑或有機溶劑等[29]。YEL等[30]用不同類型的細胞破碎方法來回收微藻油脂。結果表明，正己烷法超聲處理可顯著提高總油脂的得率，且外觀澄清透明。與單獨使用溶劑相比，油脂產率提高了1.4倍，最佳提取條件下，油脂得率為30.2%。SKORUPSKAITE等[31]研究了超聲波法和超均質法對小球藻的細胞破碎效率。超聲60 min，同時冷凍微藻，最大微藻細胞破碎效率為52.6%。超均質法在破碎微藻細胞時效率較低，但隨著轉速的增加，效率逐漸提高。轉速為24 000 r/min，冷凍微藻，在60 min內效率達到48.5%。

超聲波法也依賴于空穴效應，只是產生空穴依賴的是超聲波，而不是流體的湍動。超聲波法破壁具有效率高、時間短、適應性廣等優點，有利于節約能源和改善環境污染。但一般用于實驗室，難以在大生產中使用，超聲波器件也無法實現在線不停機維修。

2.2.2 微波法破壁

微波法破壁的基本原理為細胞內的極性物質（如水分子等）吸收微波能量，使細胞內溫度急劇升高，細胞內水分汽化從而產生巨大的內壓力，使細胞膜和細胞壁受到沖擊。另外，微波帶來的電穿孔效應以及自由基效應使細胞膜的通透性增大，細胞壁中的果膠和纖維素組分受到嚴重破壞，導致細胞破壁[32]。頻率為2 450 MHz的微波破壁，加熱、干燥的效果最好，此外，低濃度的料液破壁效果比高濃度的料液破壁效果好[33]。CHENG等[34]研究表明，微波處理時間從0 min升高到20 min后，小球藻細胞壁的厚度由0.11 μm增加到0.59 μm，而細胞壁上的孔徑由0.005 μm增加到0.18 μm，即微波處理使細胞壁變得厚而疏松。

LEE[35]采用高壓均質法、酸熱法、微波法、超聲法和10% NaCl溶液浸泡預處理后，利用甲醇-氯仿（體積比為1∶1）分別提取葡萄藻、小球藻和柵藻中的油脂，結論表明微波法的油脂提取率最高。BALASUBRAMANIAN等[36]設計了一套連續微波破壁提取系統：1.2 kW，2 450 MHz，處理濕藻含量50%的料液， 95 ℃，30 min，提取率達到76%～77%，而同樣條件下的熱水浴提取率只有43%～47%。HEO等[37]研究了高溫蒸煮、微波法、滲透壓沖擊法以及超聲波法對小球藻的破壁過程，幾種方法在保證油脂提取率的前提下，微波法處理過的小球藻糖類物質的提取收率最高，便于藻類培養產物的綜合利用。

目前，微波破壁技術成為實驗室微藻細胞破壁的有效方法，但是微波破壁受到設備功率的限制，且存在電離輻射風險，難以實現大規模應用。與此相對應的是，市場上有多家廠商提供實驗室用微波破壁機，然而提供工業規模微波破壁機的廠家極為罕見。

2.2.3 高頻脈沖電場破壁

脈沖電場破壁是指通過在細胞壁上施加大于36 V/μm的高頻交流電，產生高于360 kV/cm 的電位梯度，微藻中帶電荷離子在不同位置的濃度隨電流方向周期性變化，細胞內極性分子的空間取向也隨電流發生高頻變化，離子之間、分子之間相互摩擦和碰撞，從而實現細胞結構的破壞。

LAI等[38]研究了高頻脈沖電場（強度為30.6 kW·h/m3）處理后，柵藻（Scenedesmus sp.）的脂肪酸甲酯的提取率比未處理組提高3.1倍。同時，SYTOX-green染料細胞結合率由4.7%提高到96.8%，意味著細胞通透性地急劇增加。LUENGO等[39]的研究說明，從微藻中提取葉黃素，微藻經25 kV/cm高頻電場處理后，葉黃素的提取率提高了3.5～4.2倍。OriginOil公司的一步法采用電磁法和超聲法破壁，結合pH值調節，使藻細胞壁破裂，將細胞中的油脂釋放出來[40]。

張若冰等[41]研究了利用清華大學自主研制的高壓脈沖電源系統，對小球藻破壁，發現高壓脈沖電場強度和脈沖注入能量密度是影響高壓脈沖電場處理效果的關鍵因素，而脈沖寬度、脈沖重復頻率、電場極性對小球藻的處理效果影響不大。當電場強度從2.5 MV/m增加到5.0 MV/m時，20 mS/m電導率下的小球藻細胞破碎率從17.21%增加至83.29%;當脈沖注入能量密度從8.9 kJ/L增加到149.52 kJ/L時，4.5 MV/m電場強度作用下的小球藻細胞破碎率從9.78%提高到81.78%。

楊倩等[42]研究優化了脈沖電場輔助下以低毒溶劑提取微藻油脂的過程，得到的最佳工藝為場強20 kV/cm、流速5.4 L/h，頻率130 Hz，脈寬6 μs，循環次數3次。該條件下油脂提取率為61.1%，與傳統方法相比提高了15.9%。

CARULLO等[43]研究了脈沖電場和高壓均質法對小球藻的破壁過程，發現細胞膜的通透性隨脈沖電場的增加而增加，并不產生細胞碎片，而高壓均質法會產生大量細胞碎片。脈沖電場法在細胞低通透性時，可促進糖類和低分子質量蛋白的選擇性提取。而高壓均質法則無差別地提高胞內各種產物的提取收率，糖類的提取率比脈沖電場法高1.1倍，蛋白的提取收率比脈沖電場法高10.3倍。這說明脈沖電場法適合小分子胞內產物的選擇性提取，而高壓均質法可以作為破壁工序的最后一道環節是提取大分子質量的胞內產物。

LAM等[44]采用萊茵衣藻（C.reinhardtii）的細胞壁缺失突變藻種來模擬去除細胞壁的微藻，研究使用脈沖電場技術促進胞內蛋白的釋放。結果表明，細胞壁缺失突變藻種的胞內親水性蛋白可以完全釋放，即便是低能量（0.05 kW·h/kg）輸入時，仍有70%的蛋白可以釋放。而疏水性的葉綠體完全留存于藻細胞內部。電鏡照片表明：脈沖電場僅僅是打開了藻細胞，而沒有把藻細胞破碎。

高頻脈沖電場破壁是一種比較溫和的方法，在細胞外形基本不變的情況下，增加其通透性，可選擇性釋放細胞內的色素、糖、脂類等物質。作為一種新技術，目前仍在研究探索階段，還沒有足夠的證據和工業設備來支撐工業化破壁需求。

2.3 熱解法破壁

2.3.1 蒸汽爆破法破壁

蒸汽爆破法早先被用于木質纖維素材料的預處理，木質纖維素加熱到180～240 ℃，0.10～0.35 MPa（1.03～3.45 atm），維持幾分鐘，然后壓力突然降為常壓，木質纖維素就會爆破膨化，也會造成細胞壁的嚴重破壞。黃睿等[45]通過瞬時彈射式蒸汽爆破處理濕藻細胞。當蒸汽爆破預熱時間增加到5 min時，藻細胞的分形維數從初始的1.53増大到1.65;隨著蒸汽爆破的生物質填充率降低，藻細胞平均直徑從1.69 μm降低到1.44 μm。藻細胞表面產生的爆破缺口面積（0.08～0.22 μm2）隨著蒸汽爆破壓的升高而增大。蒸汽爆破使微藻細胞的破壁能耗由傳統方法的33～529 MJ/kg顯著降低到8.15 MJ/kg，使濕藻油脂萃取率由未處理時的56%提高到93.9%。CHENG等[46]研究了瞬時彈射式蒸汽爆破技術處理微擬球藻，發現微藻細胞壁孔面積隨蒸汽壓力的升高（1.0～2.1 MPa）而增大，配合溶劑提取技術，油脂的收率達76.5%，而對照組只有36%。蒸汽爆破法高能耗的特點限制了其應用的推廣。GNERKEN等[47]開發了一種新的連續裝置和方法，以CO2為基礎的爆炸減壓處理微藻生物質。

新型連續裝置與傳統間歇式的實驗比較表明，該裝置的處理時間縮短了3.2～9.6倍，生物量和生化釋放效率提高了2倍以上，CO2消耗量降低了2～4倍。

蒸汽爆破法由于需要高溫、高壓的條件，因此僅適用于細胞壁結構致密，目標產物耐高溫高壓、穩定不易分解的情況，比如油脂提取等，小型或者規模生產的設備都可以買到。

2.3.2 熱解液化法破壁

熱解液化法指的是利用超臨界或亞臨界的水（280～370 ℃，10～25 MPa），其密度、介電常數、離子積、黏度、熱導率、擴散系數和溶解性能都發生明顯改變。在超/亞臨界水中，水作為溶劑及反應物，具有高效溶解、快速傳質及有效打斷高分子碳鏈的作用，因此能夠破壞細胞壁分子，進而直接液化為生物柴油，藻類生物油的主要成分包括苯酚及其衍生物、含氮雜環化合物、長鏈脂肪酸、烴類、植物醇和膽固醇的衍生物等，其產物油的熱值可高達39 MJ/kg[48]。YOO等[49]報道了相對低一些的溫度（200 ℃）有益于獲得高質量的生物油脂。HU等[50]研究了化學法（NaOH/尿素法，硫酸法以及超聲波法）作為熱解液化的預處理手段，NaOH/尿素預處理法導致33.7%的干物質損失，77.2%糖類的損失，46.3%的蛋白質損失，但是其熱解液化過程的能耗顯著降低，且油脂的提取收率高，油脂的流動特性很好。LI等[51]研究了利用熱解液化法從小球藻提取油脂的過程，優化后的條件是320 ℃，60 min，油脂的提取收率是38.1%。

CHENG等[52]在亞臨界水（310～350 ℃，0～17 MPa）條件下熱解液化高油脂含量微藻鹽水微綠球藻以及低油脂含量。紅藻（Galdieriasulphuraria），在最佳條件下，鹽水微綠球藻和紅藻的生物柴油得率分別是59%和31%。能量平衡分析表明：鹽生紅藻有85%的能量進入生物柴油，而紅藻只有59%的能量進入生物柴油。CHEN等[53]合成了負載過渡態金屬 （Ni， Pd， Co和Ru）的中孔SBA-15分子篩用于催化微藻的熱解液化過程。結果表明，負載的金屬在613 K溫度下表現出很好的熱解液化穩定性。該催化劑顯著影響了液化產物的組成，糠醛類產物增加，而脂肪酸以及含氮產物下降，生物柴油的質量顯著提升，轉化率達到78.78%，生物柴油的產率達到24.11%。WADRZYK等[54]研究了以熱解液化法亞臨界水處理柵藻細胞獲得生物柴油的過程，推斷了反應機理，發現所得生物柴油的特性參數可以通過調整亞臨界水熱解液化的工藝參數實現。

熱解液化法與蒸汽爆破法類似，反應條件苛刻，也僅適用于細胞壁結構致密，產物耐高溫高壓、穩定不易分解的情況，比如油脂提取、纖維素提取等。其他生物產物，比如蝦青素等，不能采用這種方法破壁。

2.4 化學法破壁

2.4.1 離子液體破壁

離子液體作為離子化合物，一般由有機陽離子和無機或有機陰離子構成，常見的陽離子有季銨鹽離子、季鏻鹽離子、咪唑鹽離子和吡咯鹽離子等，陰離子有鹵素離子、四氟硼酸根離子、六氟磷酸根離子等，可在0～140 ℃呈現液態，其熔點低的主要原因是結構中某些取代基的不對稱性使離子不能規則地堆積成晶體所致。由于其不易燃，具有良好的熱穩定性，高熱容，低蒸汽壓，用于藻類破壁及提取具有一系列優點：縮短操作時間，溶劑可重復使用，萃取率高等。KIM等[55]利用離子液體[Bmim]CF3SO3，以甲醇作為助溶劑，油脂提取率達到19%，遠高于采用氯仿/甲醇的提取率（11%）。PRAVEENKUMAR等[56]嘗試使用各種離子液體從雨生紅球藻中萃取花青素，配合使用生物萌發工藝，以[Emim]EtSO4為萃取劑，1 min可使花青素的收率達到19.5 pg/g，是傳統高壓均質法有機溶劑萃取法收率的82%。

作為一種新型破壁技術，離子液體破壁具有操作時間縮短，溶劑可重復使用，萃取率高等優點，缺陷主要是離子液體價格昂貴，且在產物中的殘留對人體健康的影響不明確，因此距離大規模應用尚有一定的距離。

2.4.2 納米粒子破壁

低濃度的金屬離子，如鐵和鎳一般對微生物代謝是有益的，但是過量的金屬離子會破壞細胞的生理功能。由于金屬氧化物納米顆粒能夠產生活性氧，進而破壞細胞，吸引一些人利用金屬氧化物納米顆粒進行細胞破壁，同時氧化鎳（鐵）納米顆粒能夠被磁鐵吸附，因而便于應用磁分離技術從水中提取藻類細胞。

HUANG等[57]研究了利用納米氧化鎳顆粒（小于50 nm）提取并破壁藻細胞。結果表明，1 min，pH值為7的條件下，藻細胞的提取率達到98.8%，而且經過96 h的氧化鎳納米顆粒處理后，油脂的提取率達到91%。陽離子表面活性劑修飾的鐵氧化物納米顆粒[58]，十六烷基三甲基溴化銨-四氧化三鐵（CTAB-Fe3O4），在0.46 g/（g細胞）的劑量下小球藻提取率達到96.6%。另外，通過添加十二烷基硫酸鈉SDS，可以使藻細胞與CTAB- Fe3O4納米顆粒分離，使得納米顆粒得以循環利用，應用前景良好。WANG 等[59]利用納米催化劑M/TiO2（M=Fe， Co， Ni， Mo， Mn）催化微綠球藻的熱解液化過程，Ni/TiO2催化效率最高，其最佳反應溫度為300 ℃，轉化率為89.28%，可添加Ni/TiO2降低體系黏度，所得生物柴油中的低沸點組分增加。

作為一種新型破壁技術，納米粒子破壁尚處于嘗試探索階段，距離大規模應用還很遠。

2.4.3 氧化法破壁

LEE等報道以二氧化鈦為光催化氧化劑，在紫外光照射下，通過水氧化產生羥基自由基（OH·），可有效攻擊藻細胞。HUA等[60]設計了反應式電化學膜過濾系統（Ti4O7-REM），旨在將藻細胞的膜過濾分離與藻細胞的電化學氧化預處理偶合在一起。結果表明，在保證過濾通量的前提下，雙型柵藻（Scenedesmus dimorphus）藻細胞的形態明顯受到破壞，光合作用活性明顯下降，可歸因于多孔二氧化鈦催化的氧化作用，油脂提取的收率也增加了50%左右。ULKER等[61]研究了使用臭氧破壁微藻細胞，1 g干細胞0.5 g臭氧劑量下，臭氧的破壁效率顯著高于酸、堿溶液以及超聲波處理。CARDEA等[62]研究了以臭氧處理微藻細胞來促進厭氧酵解甲烷的過程。結果表明，臭氧處理可以顯著提高甲烷的產量，1 g微藻揮發性固體產生甲烷的量最高可達432.7 mL，比對照組高出66%。電鏡圖片表明，臭氧處理對藻細胞壁結構的完整性造成了顯著破壞。

生物法破壁指的是利用生物體自身或者其他生物體生長代謝過程中產生的一系列酶，催化水解細胞壁。該方法具有酶法裂解細胞的所有優點，條件溫和、能量需求低，主要缺點是需要篩選特異的菌株或病毒。

3 總結與展望

與微生物細胞相比，微藻細胞壁結構致密，含有難以分解的多糖類物質（纖維素、半纖維素以及幾丁質），含量在45%以上，破壁難度大，成為微藻產業化的一大制約因素。目前的破壁方法在技術可行性或者在經濟性上存在不足，距離大規模生產的需求尚有一定距離。

化學法與機械法二者結合使用，是一種比較可行的產業化技術路線。采用化學法，用酶、酸、表面活性劑等進行預處理，再用高壓均質機或珠磨進行機械法破壁，可以解決大部分藻細胞的破壁問題。

如果目標是生物油脂，可將有機溶劑浸提與高壓均質機法配合，優化各工藝條件（溶劑種類及用量、破壁溫度、均質壓力與次數等），以油脂收率評價破壁效率，油脂收率可以達到90%以上。如果目標產物是小分子生物活性物質，比如蝦青素、葉黃素等，分子結構中存在不少共軛不飽和碳碳雙鍵，易氧化，對光熱敏感，破壁工藝的選擇尤其要考慮目標產物的活性。采用機械法破壁時，需考慮配備冷卻系統，以保證料液不會因機械破壁導致溫度大幅升高，從而破壞目標產物的生物活性。而且機械破壁過程中，會帶來泡沫，增加目標產物被氧化的可能性，因此破壁前需考慮適當添加還原劑保護目標產物。

生物法破壁最具發展前景。自然界生態平衡使得任何一種生物都存在天敵，藻類也逃脫不了這一定律。任何一種藻類都可以篩選到與其對應的殺藻菌或病毒，同時藻類自然萌發破壁技術，因此生物法破壁對于絕大多數藻類具有技術可行性。同時生物法具有條件溫和、常溫常壓、pH值近中性、低能量消耗的特點，使其具有經濟可行性。對光熱敏感、怕氧化的生物活性物質，生物法破壁是更好的選擇。由于生物之間具有相互作用的特異性，因此可根據不同微藻的特性，采用適宜的天敵生物進行破壁，需要加大在科研與技術開發方面人力、物力的投入。待適宜的生物法破壁工藝成熟后，如能長期應用于工業生產中，日積月累，生物法破壁的環境效益和經濟效益就會超過化學-機械法破壁。

目前，微藻相關產業正處在從實驗室走向商業化大規模生產的階段，規?；⒃迮囵B系統不斷出現，而與此配套的規?；票诩夹g仍是限制性環節。建議研究者們應加強研發力度，積極開發生物法破壁技術。

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收稿日期：2019-12-11;修回日期：2020-05-07;責任編輯：王淑霞

基金項目：河北省自然科學基金（C2016208052）

第一作者簡介：劉俊果（1968-），女，河北冀州人，副教授，博士，主要從事生物產物分離提取與純化方面的研究。

E-mail：1308676013@qq.com

劉俊果，董堯坤，張園園.

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