WRKY響應植物逆境的“角色”

張金梅 白雪 李玥瑩

摘要 植物經常面臨大量的逆境脅迫，這些逆境脅迫會對植物造成一些不利影響。為了應對這些脅迫，植物通過一個嚴格調控的網絡機制來迅速作出響應。WRKY家族是一類廣泛參與響應脅迫的轉錄因子家族，作為激活因子或者抑制因子來參與轉錄組的重新編程。綜述了逆境脅迫中WRKY基因在植物抗性機制中扮演的“角色”及其發揮的作用。

關鍵詞 WRKY;逆境脅迫;調控;角色

Abstract Plants often face a great deal of stress，which will have some adverse effects on plants.In response to these stresses，plants respond quickly through a tightly regulated network of mechanisms.WRKY family is a family of transcription factors that are widely involved in response to stress and participate in transcriptome reprogramming as activators or inhibitors.In this paper，we reviewed the role of WRKY gene in plant response to stress and homology in other plants.

Key words WRKY;Stress of adversity;Regulation;Role

植物在逆境脅迫下會引發很多問題，如合成激素信號通路的中斷，干擾激素信號傳導會抑制植物的生長和發育，光合作用受到抑制，誘導植物衰老，細胞程序性死亡，細胞損傷，活性氧生成增加，細胞內穩態和滲透調節平衡受到破壞，嚴重時將導致植物死亡[1-3]。為了應對各種逆境脅迫，植物通過一系列生理、代謝以及分子水平上的防御機制來提高植物的耐受能力。

WRKY轉錄因子是存在于高等植物中的一大類轉錄調控因子，它是通過特異性的結合目標基因啟動子的W-box、WRKY域和其他蛋白質的相互作用，還有翻譯后修飾加工[4-8]。WRKY在逆境脅迫中會扮演不同的“角色”，控制參與響應脅迫的關鍵物質的生物合成。植物在逆境脅迫下形態、生理以及分子機制方面都會發生變化，WRKY在這一系列變化中起重要作用。Bai等[9]報道在番茄中有83個WRKY基因被鑒定出來。萬紅建等[10]報道了這些WRKY基因廣泛參與生物與非生物脅迫。

1 WRKY參與非生物脅迫與生物脅迫

WRKY轉錄因子是植物生長和發育的主要調節因子。鹽脅迫條件下的WRKY蛋白參與植物的不同生理和發育過程，如種子大小調節、種皮發育、葉片發育和葉片衰老調節[11-12]。WRKY轉錄因子參與不同水平的激素調節，響應植物在各個發育階段的脅迫，如在鹽脅迫和滲透脅迫下，植物激素脫落酸在響應脅迫中快速積累，吲哚乙酸、赤霉素、茉莉酸、水楊酸、油菜素類固醇和乙烯ctr1-1或EIN3的過量表達從而提高耐鹽性，誘導或調節種子萌發率和幼苗生長[13]。從陸地棉（Gossypium hirsutum）中分離出WRKY41（GhWRKY41）并轉化到煙草（Nicotiana benthamiana）中，得到轉基因植株，GhWRKY41過表達，降低了植株中丙二醛含量，調節氣孔關閉，抗氧化酶活性增強以及相關基因的上調，使植物對鹽和干旱脅迫的抗性增強[11-12]。在王秀玲等[14]研究中轉基因植物GhWRKY40過表達植株在對生物脅迫青枯細菌的侵染中表現出敏感性。GhWRKY40在SA/JA信號途徑中起作用，且對傷脅迫和青枯細菌侵染的響應具有協同作用，經驗證GhWRKY40和GhMPK20互作于細胞核內， GhWRKY40被GhMPK20激活表達參與脅迫響應。

WRKY轉錄因子也參與干旱脅迫應答，植物在干旱脅迫下嚴重降低了芽和幼苗的數量，顯著降低了植物水分利用效率，影響植物光合作用，導致光合色素和成分變化、光合器官受損和卡爾文循環酶的活性下降，同化物分配降低了光合速率，擾亂了葉片的碳水化合物代謝和蔗糖水平，使呼吸代謝速率下降，導致植物在碳資源的利用中不平衡、生成氧種類減少等影響。AtWRKY40在擬南芥應對干旱脅迫響應中調節一系列抗氧化酶活性從而響應干旱脅迫誘導[15];AtWRKY40缺失導致干旱脅迫下種子的萌發率降低，葉片失水加劇，當它過表達時則表現相反的表征，較于野生型植株，AtWRKY40缺失突變體植株葉片的抗氧化酶活性、脯氨酸（Pro）以及相關基因AtCu/ZnSOD、AtCAT1、AtP5C1S、AtG6PD5和AtBAM4表達量和可溶性糖含量都顯著降低，而過表達株系則比野生型植株的抗氧化酶活性、基因的表達量和滲透物質的含量都顯著增高[16]。AtWRKY40在應對病原菌的侵染過程中受病原菌的誘導，從而合成一些植保素來防御病原菌的侵害。也與其同一來源的基因串聯復制使被侵染病原菌的植株抗性增強。

袁柳嬌等[17]根據轉錄組分析發現了秋茄通過調節自身的基因表達情況來提高自身對受污染環境中重金屬的耐受能力。對于金屬非超積累植物，谷胱甘肽（GSH）和植物金屬螯合素（PC）之間的平衡對于提高Cd的耐受能力非常重要。當AtPCS1基因過表達時，PC的合成升高，導致GSH的消耗，這有助于增強氧化應激和Cd的敏感表型[18]。 研究發現，WRKY13通過谷胱甘肽獨立的PC合成途徑調控Cd耐受，WRKY蛋白可以作為轉錄激活因子或者轉錄抑制因子。作為轉錄激活因子時，通過直接與PDR8啟動子的W-box結合，正向調節鎘耐受，合成木質素，而作為轉錄抑制因子與下游靶基因作用，控制開花時間。水稻WRKY13選擇結合順式作用元件W-box結構完全不同類型的PRE4元件，調控不同脅迫中信號路徑間的交互作用，如在水稻受干旱脅迫時發揮抑制功能調節氣孔關閉，可以與SNAC1啟動子區不同的順式作用元件選擇性結合進行負調控;當選擇性結合到WRKY45啟動子區不同的順式作用元件上，也可以發揮同樣的抑制功能。在水稻受病原菌侵染過程中，還可以結合另一個與W-box結構完全不同的PRE4順式作用元件，激活自身基因的表達[19]。

2 WRKYs組成的基因簇協同作用

在植物防御系統中擬南芥WRKY18、WRKY40、WRKY60這3個結構相關的轉錄因子均受病原菌的誘導[20]，研究表明這3個轉錄因子可以形成AtWRKY18-40-60簇，且是ABA信號調節的關鍵因子。形成同源和異源復合物是通過自身的亮氨酸拉鏈結構，所以產生的 WRKY蛋白的DNA結合活性會有顯著差異。基因簇是通過單個基因重復產生的多個拷貝，因此來源、結構和功能以及由其編碼的蛋白質產物都存在相似性，這類家族基因一個區域內串聯復制緊密排列在一起形成一個基因簇。高密度基因簇，包括Hox域和C2H2鋅指結構基因域等[21]。一個基因簇組成的突變體能夠增強植物的基礎防御作用，對防御途徑中的平衡也起重要作用，協同調控使植物抗性增強[22-23]。

ATWRKY18是一種病原和水楊酸誘導的擬南芥轉錄因子，包含植物特異性WRKY鋅指DNA結合基序。ATWRKY18的高水平表達轉基因植物生長遲緩，當在中等水平表達時，ATWRKY18增強了轉基因植物的發育，調節防御反應，且不會對植物生長造成實質性的負面影響。ATWRKY18增強發育、調節防御反應需要抗病調節蛋白npr1/nim1。因此，ATWRKY18可以積極調節防御相關基因的表達和抗病性[24]。ATWRKY40是作為抑制因子抑制抗霉素A誘導的高光誘導信號傳導和線粒體的逆行表達，ATWRKY40也是參與調節編碼線粒體和葉綠體蛋白的應激反應基因。此外，ATWRKY40參與調節線粒體和葉綠體的功能，逆境脅迫下共同激活應答基因的表達。研究表明，ATWRKY40在植物干旱脅迫反應中也發揮了積極作用，可能是通過干擾活性氧清除途徑和滲透液積累過程。干旱脅迫下，野生型植物WRKY40表達強烈，功能喪失突變體在干旱條件下種子發芽率下降，葉片失水率上升，而在過表達系中則表現出相反的趨勢。此外，ATWRKY40突變體植株積累的丙二醛（MDA）比野生型和過度表達植株多，表明突變體脂質過氧化水平提高。WRKY18、WRKY40、WRKY60產生的WRKY蛋白在植物響應2種不同類型的病原體中具有部分冗余的作用，WRKY18比其他2種更重要[20]。病原菌侵染時，三突變體比野生型防御對半活體營養型細菌表現更抗，但對壞死營養型真菌表現更感。在進行基因敲除時，必須將3個基因全部敲除才能達到目的。

研究發現，在假單孢桿菌和黑球病菌侵染的巨桉植株中，EgrWRKY70、EgrWRKY46、EgrWRKY53這3個結構類似的基因與激素水楊酸、茉莉酸甲酯具有協同作用，且誘導起正調控作用表現出抗性[22，25-26]。研究還發現，參與Br油菜素甾體類調控的植物生長和干旱響應過程中3個擬南芥WRKY轉錄因子WRKY46、WRKY54和WRKY70結構相似功能冗余，這三重突變體在干旱脅迫下對Br調控的植株生長存在缺陷，但耐受性更強。經轉錄組測序分析表明，在促進Br介導的基因表達和抑制干旱反應基因中直接相互作用的是WRKY54與BES1，協同調控靶基因的表達，WRKY54被類似GSK3的激酶Br-Insensive2磷酸化，BES1是Br通路的負調節因子[27]。

3 WRKY調節代謝物的生物合成

WRKY轉錄因子調節特定代謝物的產生，作為特化代謝的關鍵調控因子，如通過調控乙烯合成酶相關基因的表達，參與其生物合成[28-29]。WRKY轉錄因子被發現是控制代謝的關鍵限速步驟，調節多種酚類化合物的產生，調節苯丙類通路中木質素的產生，控制黃酮醇和單寧化合物的生成，所以它也是生物堿代謝的關鍵調控因子。WRKY轉錄因子對萜烯通路的調節，如從陸地棉中分離出來的GaWRKY1，從黃花蒿中分離出來的AaWRKY1，從水稻中分離出來的OsWRKY13，分別作用特定代謝的關鍵酶CAD1-A、ADS、查爾酮合成酶（CHS），特異性結合相關的啟動子ADSpro2、Os01g24980、Os08g44830，從而合成倍半萜類棉子酚、倍半萜類青蒿素、倍半萜類黃酮[30-35]。

4 WRKY參與植物信號轉導

WRKY轉錄因子參與植物脅迫響應中的信號通路，參與許多植物激素信號轉導級聯包括脫落酸、生長素、油菜素、類固醇、細胞分裂素、乙烯、茉莉酸和水楊酸等[36]。研究發現，絲裂原活化蛋白激酶 （mitogenactivated proteinkinase，MAPK） 介導的磷酸化調控會影響某些 WRKY 轉錄因子的活性[37]。當受到脅迫應激時，植物活性氧的大量積累，氧化信號誘導型OX1蛋白檢測到了植物細胞中ROS的產生和積累，這些蛋白質就會刺激下游絲裂原活化蛋白激酶級聯的快速信號轉導，在胞質中MAPK級聯是從MKKK到MKK再到MPK的三級磷酸化，來自MAPK級聯的信號將進一步轉導至轉錄因子激活細胞核中的轉錄因子功能，結合特定的順式作用元件并誘導響應抗性相關基因脫落酸等的表達[36，38]。WRKY轉錄因子應激調控OsBWMK1S的表達，在應答過程中發生了不同程度的磷酸化，在OsMKK6轉基因過表達植株中，OsWRKY50表達上調，在依賴水楊酸的防御反應中，OsBWMK1磷酸化與PR基因啟動子結合的W-box序列，OsWRKY53作為OsMPK3/OsMPK6正調控因子，并與這些MPKs相互作用，降低了茉莉酸和乙烯的誘導，提高了抑菌效果[39-40]。

5 WRKY影響表觀遺傳學調控

表觀遺傳學是控制染色質的可達性，全基因組的染色質修飾，DNA的復制、修復以及結合的轉錄機制，有DNA甲基化和乙酰基化等[41]。表觀遺傳對水稻WRKY基因的表達有一定影響。WRKY基因的應答在DNA甲基化水平上被調控。在耐旱條件下，水稻OsWRKY70 和OsWRKY45甲基化程度高則表現為下調，甲基化程度低OsWRKY90表現為上調;鹽脅迫下，OsWRKY104高程度甲基化基因表現為下調[42]。在種子發育過程中，OsWRKY2甲基化程度的變化和表達變化之間呈負相關，此外OsWRKY71轉錄本和組蛋白H4乙酰化在RNAi中被誘導，表明HDT701作為植物防御的負調控因子，并通過乙酰化和去乙酰化過程調節WRKY基因的表達[43-44]。在稻瘟病抗性誘導中，OsWRKY45-1和OsWRKY45-2 2個等位基因產生的抗性存在差異，插入1個編碼為TE-siR815的內含子，在OsWRKY45-1的第一個內含子中，ST1基因被抑制，經導向RNA的DNA甲基化，ST1基因是WRKY45介導耐藥的重要基因，這種突變導致抗病性表現為OsWRKY45-1的負作用和OsWRKY45-2的正作用[44-45]。

6 CRISPR/Cas9介導的WRKYs基因編輯

最新突破性的基因組編輯技術 （CRISPR）/Cas是一種簇狀、有規則間隔的回文重復序列系統，已成為占主導地位的基因組編輯工具。CRISPR/Cas系統主要可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種類型，其中最簡單和最常用的類型CRISPR/Cas9系統是膿毒鏈球菌的II型系統[46-48]。CRISPR/Cas9系統可引入包括堿基替換，插入突變和缺失突變等多種突變類型[49]。與之前的不同，CRISPR/Cas系統可以同時編輯多個基因在多個位點引起突變[50-54]。以CRISPR/Cas9系統介導的甘藍型油菜基因組定向改變其基因型來探究。首先利用農桿菌介導的遺傳轉化技術構建針對甘藍型油菜BnWRKY11和BnWRKY70基因的表達盒，構建Cas9、gRNA與Cas9形成復合物，使其轉染到細胞，并引導酶切割目標DNA，與RNA通過互補序列結合，細胞試圖修復DNA斷裂，這就導致插入或刪除，改變其閱讀框，提前形成終止密碼子，然后在T0代或T1代對目標位點進行擴增和測序，結果表明，BnWRKY70基因的過表達會降低對菌核病的抗性，利用CRISPR/Cas9系統可以在油菜甘藍中產生多個同源突變植株，在定向改變基因中具有較高的編輯效率，可以在有限的世代內產生純合突變體，所以表明可以利用其來提高油菜對病原菌的抗性[55]。

7 展望

近年來，隨著研究發現WRKY轉錄因子家族演繹的角色逐步被解密，通過在染色體水平、基因分子水平上的分析研究，展示了WRKY所扮演的多元化調控角色，了解到WRKY轉錄因子的重要性，特別是在抗逆境生理脅迫中。可以從其各種角度，如WRKY的種類、功能作用、各種類相關聯性、調控網絡等，在植物育種方面的價值，挖掘出它更深刻的意義，提供更完善的WRKY轉錄因子家族的理論基礎。

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