miRNA-4262通過靶向神經調節蛋白1調控非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲、遷移的作用機制△

王旭，徐文舉，袁五營

河南省胸科醫院微創外科，鄭州 450000

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）主要包括腺癌和鱗狀細胞癌，每年因NSCLC死亡的人數占惡性腫瘤死亡人數的1/6[1]。盡管目前臨床上對NSCLC的治療取得了一定的進展，但是NSCLC細胞容易復發和轉移的特性仍然影響患者預后。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）參與NSCLC的發生發展[2]。miRNA通過與靶基因的3'UTR區域結合降解靶基因的mRNA水平，調控靶基因水平，進而影響細胞的增殖、分化、遷移、凋亡等過程[3]。研究報道，miRNA-4262通過調控骨橋蛋白的表達發揮對骨肉瘤細胞的促侵襲作用[4]。miRNA-4262通過KLF6介導的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）失活和p21表達上調促進人皮膚惡性黑色素瘤細胞的增殖[5]。研究報道，神經調節蛋白1（neuroregulatory protein 1，NRG1）與腫瘤的發生發展相關，且影響腫瘤相關信號通路的改變[6]。研究顯示，NRG1在甲狀腺癌組織中低表達，NRG1過表達能夠抑制甲狀腺癌細胞的增殖，誘導甲狀腺癌細胞的凋亡[7]。然而，miRNA-4262在NSCLC細胞中的表達及其對NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲的影響，以及miRNA-4262是否通過靶向NRG1影響NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移目前還尚未可知。本研究分析了miRNA-4262是否靶向NRG1影響NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移，以期為臨床靶向治療提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

NSCLC細胞株A549、H1299、H1650和正常肺上皮細胞BEAS-2B均購自中國科學院上海細胞庫，DMEM培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司，噻唑藍（MTT）試劑盒購自北京博奧拓達科技有限公司，LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9、MMP14、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗均購自美國Abcam公司，NRG1、p21、p27一抗均購自美國CST公司，實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自日本Toyobo公司，免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Transwell板購自美國Corning公司，qRT-PCR儀購自美國ABI公司，凝膠成像系統購自德國Analytik Jena AG公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將 BEAS-2B、A549、H1299、H1650細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，在5%CO2、37℃培養箱中進行傳代培養。

1.2.2 載體構建及細胞轉染 體外合成miRNA-4262的反義互補序列，構建anti-miRNA-4262質粒及其陰性質粒anti-miRNA-NC；合成miRNA-4262的前體序列，構建miRNA-4262 mimic質粒，同時構建si-NC、si-NRG1質粒。于24孔板中培養A549至對數生長期，棄去培養基，加入無血清和無雙抗的培養基中“饑餓”培養6 h，以增加轉染效率；采用LipofectamineTM2000將anti-miRNA-4262、anti-miRNA-NC、si-NC、si-NRG1質粒分別轉染入A549細胞中，轉染后4～6 h更換完全培養基。獲得穩定低表達miRNA-4262的A549細胞株，在穩定低表達miRNA-4262細胞株的基礎上轉染si-NRG1、si-NC獲得穩定細胞株anti-miRNA-4262+si-NRG1和antimiRNA-4262+si-NC，培養48 h后進行后續實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測miRNA-4262、NRG1基因表達上述處理后的細胞提取總RNA，分別以U6、β-actin為miRNA-4262、NRG1的內參基因。qRT-PCR反應體系為 20 μl：2×SYBR Mix 10 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA 模板 1 μl，H2O 8 μl。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環。miRNA-4262上游引物為5'-AATTCAGTTGAGGAACAGGTA-3'，下游引物為5'-CTGGGCCCAGTGTTCAGACTACC-3'；U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-TCACGAATTTGCGT-3'；NRG1上游引物為5'-GGCAGTCAGCCCCTTTGTG-3'，下游引物為 5'-TGCAGGGTTGTGATGAAAGGA-3'；GAPDH上游引物為 5'-ATGACTCTACCCACGGCAAG-3'，下游引物為5'-GG AAGATGGTGATGGGTTTC-3'。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測蛋白表達情況 上述處理后的細胞提取總蛋白，測定總蛋白濃度。每種蛋白按照30 μg上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，脫脂奶粉封閉1.5 h；一抗（GAPDH、cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP14、NRG1、p21、p27）4 ℃孵育過夜，然后與二抗室溫孵育1 h；電化學發光顯影液顯影，凝膠成像儀采集圖片，以GAPDH為內參，應用Image J系統分析光密度值，計算蛋白表達水平。

1.2.5 MTT 法檢測細胞增殖情況 在細胞中加入MTT試劑20 μl混勻，培養4 h；加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液100 μl混勻，培養15 min；酶標儀檢測490 nm處的吸光度值（optical density，OD）。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力遷移實驗：Transwell的上室以每孔104個細胞添加，下室加入DMEM培養基，培養12 h后棄去上室中的培養基，棉簽擦除未穿過的細胞，固定，結晶紫染色，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗；隨機選取5個低倍鏡視野進行觀察，計算穿膜細胞數。侵襲實驗：實驗前將Matrigel膠置于冰上解凍，按照1∶2與無血清DMEM培養基混勻，制備Matrigel基質膠；將Matrigel基質膠包被Transwell上室，每孔104個加入Transwell上室，其余操作同遷移實驗。

1.2.7 雙熒光素酶實驗檢測miRNA-4262對NRG1的影響 根據生物信息學預測的miRNA-4262與NRG1的互補序列擴增結合位點的片段，將擴增片段插入到熒光素酶載體中。構建野生型NRG1-3'UTR（WT-NRG1 3'UTR）質粒，使用點突變技術進行位點突變，構建突變型NRG1-3'UTR（MUT-pGL3-NRG1-3'UTR）質粒，將野生型NRG1-3'UTR、突變型NRG1-3'UTR與miRNA-NC、miRNA-4262分別共轉染至A549細胞中，轉染48 h后檢測熒光強度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-4262、NRG1mRNA和NRG1蛋白表達情況的比較

與正常肺上皮細胞BEAS-2B相比，NSCLC細胞株A549、H1299、H1650中miRNA-4262的表達水平均明顯升高，NRG1mRNA及NRG1蛋白表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表1）。選擇NSCLC細胞株A549進行后續實驗。

表1 不同細胞株中miRNA-4262、NRG1 mRNA和NRG1蛋白表達情況的比較（±s）

注：*與BEAS-2B組比較，P＜0.01

細胞類型BEAS-2B A549 H1299 H1650 1.01±0.09 3.24±0.31*2.81±0.27*3.05±0.29*1.02±0.09 0.42±0.04*0.31±0.03*0.37±0.03*0.89±0.08 0.48±0.04*0.39±0.04*0.42±0.03*F值P值miRNA-4262 145.327 0.000 NRG1 mRNA 340.383 0.000 NRG1蛋白186.171 0.000

2.2 miRNA-4262表達對A549細胞增殖的影響

anti-miRNA-4262組培養48和72 h的細胞活性、miRNA-4262、cyclin D1蛋白表達水平均明顯低于anti-miRNA-NC組，p21、p27蛋白表達水平均明顯高于anti-miRNA-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同組別A549細胞的活性及miRNA-4262、cyclin D1、p21、p27蛋白表達情況的比較（±s）

表2 不同組別A549細胞的活性及miRNA-4262、cyclin D1、p21、p27蛋白表達情況的比較（±s）

組別anti-miRNA-NC組anti-miRNA-4262組t值P值miRNA-4262 1.00±0.09 0.41±0.04 17.972 0.000細胞活性（OD490 nm）24 h 0.39±0.04 0.37±0.03 1.200 0.248 48 h 0.71±0.07 0.45±0.04 9.675 0.000 72 h 1.13±0.09 0.57±0.06 15.532 0.000 cyclin D1蛋白0.72±0.07 0.34±0.03 14.969 0.000 p21蛋白0.26±0.03 0.63±0.06 16.547 0.000 p27蛋白0.29±0.03 0.68±0.06 17.441 0.000

2.3 miRNA-4262表達對A549細胞遷移、侵襲的影響

Transwell實驗顯示，anti-miRNA-4262組中侵襲和遷移細胞數目均明顯少于anti-miRNA-NC組，遷移相關蛋白MMP2、MMP9、MMP14表達水平均明顯低于anti-miRNA-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3）

2.4 NRG1過表達對A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響

pcDNA-NRG1組細胞中NRG1蛋白的表達水平明顯高于pcDNA組，48和72 h細胞活性均明顯低于pcDNA組，侵襲和遷移細胞數目均明顯少于pcDNA組，cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平均明顯低于pcDNA組，p21蛋白表達水平明顯高于pcDNA組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表4）

2.5 miRNA-4262靶向調控NRG1的表達

TargetScan生物信息學軟件預測顯示，miRNA-4262與NRG1的3'UTR存在結合位點（圖1），推測NRG1可能是miRNA-4262的靶基因；雙熒光素酶報告實驗顯示，miRNA-4262-WT-NRG1組A549細胞中NRG1蛋白的表達水平顯著降低，提示miRNA-4262與NRG1的3'UTR區域特異性結合，NRG1是miRNA-4262的直接靶點。Western blot檢測結果顯示，miRNA-4262組A549細胞中NRG1蛋白表達水平低于miRNA-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；anti-miRNA-4262組 A549細胞中NRG1蛋白表達水平高于anti-miRNA-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表5），進一步證實了miRNA-4262靶向NRG1負向調控NRG1的表達。

表3 不同組別A549細胞中遷移和侵襲細胞數目及MMP2、MMP9、MMP14蛋白表達情況的比較（±s）

表3 不同組別A549細胞中遷移和侵襲細胞數目及MMP2、MMP9、MMP14蛋白表達情況的比較（±s）

組別anti-miRNA-NC組anti-miRNA-4262組t值P值遷移細胞數目116.32±10.25 52.41±6.37 15.887 0.000侵襲細胞數目103.54±9.67 41.25±4.39 17.596 0.000 MMP2蛋白0.69±0.06 0.32±0.03 16.547 0.000 MMP9蛋白0.62±0.06 0.27±0.03 15.653 0.000 MMP14蛋白0.73±0.07 0.37±0.04 13.396 0.000

表4 不同組別A549細胞的活性、遷移和侵襲細胞數目及NRG1、cyclinD1、p21、MMP2、MMP9蛋白表達水平的比較（±s）

表4 不同組別A549細胞的活性、遷移和侵襲細胞數目及NRG1、cyclinD1、p21、MMP2、MMP9蛋白表達水平的比較（±s）

組別pcDNA組pcDNA-NRG1組t值P值NRG1蛋白0.46±0.04 0.86±0.07 14.884 0.000細胞活性（OD490 nm）24 h 0.40±0.04 0.39±0.03 0.600 0.557 48 h 0.73±0.07 0.52±0.05 7.324 0.000 72 h 1.14±0.09 0.71±0.07 11.314 0.000遷移細胞數目116.37±10.69 62.36±6.38 13.015 0.000侵襲細胞數目103.74±9.81 51.35±5.33 14.078 0.000 cyclin D1蛋白0.73±0.06 0.39±0.03 15.205 0.000 p21蛋白0.24±0.03 0.59±0.05 18.007 0.000 MMP2蛋白0.68±0.06 0.34±0.04 14.145 0.000 MMP9蛋白0.63±0.06 0.31±0.03 11.685 0.000

圖1 NRG1的3'UTR和miRNA-4262序列

表5 不同miRNA-4262表達情況的A549細胞中NRG1 mRNA和蛋白表達水平的比較（±s）

表5 不同miRNA-4262表達情況的A549細胞中NRG1 mRNA和蛋白表達水平的比較（±s）

注：a與miRNA-NC組比較，P＜0.05；b與anti-miRNA-NC組比較，P＜0.05

組別miRNA-NC組miRNA-4262組anti-miRNA-NC組anti-miRNA-4262組F值P值NDRG1 mRNA 1.01±0.08 0.43±0.04a 1.00±0.09 2.24±0.21b 348.239 0.000 NRG1蛋白0.49±0.04 0.19±0.02a 0.47±0.05 0.91±0.08b 290.973 0.000

2.6 抑制NRG1的表達逆轉了抑制miRNA-4262表達對A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響

anti-miRNA-4262組48、72 h細胞活性均低于anti-miRNA-NC組，侵襲和遷移細胞數目均少于anti-miRNA-NC組，cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平均低于anti-miRNA-NC組，p21蛋白表達水平高于anti-miRNA-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。在穩定低表達miRNA-4262的細胞中沉默NRG1基因，結果顯示，anti-miRNA-4262+si-NRG1組細胞中NRG1蛋白表達水平低于anti-miRNA-4262+si-NC組，48、72 h細胞活性均高于antimiRNA-4262+si-NC組，侵襲和遷移細胞數目均多于anti-miRNA-4262+si-NC組，cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平均高于anti-miRNA-4262+si-NC組，p21蛋白表達水平低于anti-miRNA-4262+si-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表6）

表6 不同組別A549細胞的活性、遷移和侵襲細胞數目及相關蛋白表達情況的比較（±s）

表6 不同組別A549細胞的活性、遷移和侵襲細胞數目及相關蛋白表達情況的比較（±s）

注：a與anti-miRNA-NC組比較，P＜0.05；b與anti-miRNA-4262+si-NC組比較，P＜0.05

組別anti-miRNA-NC組anti-miRNA-4262組anti-miRNA-4262+si-NC組anti-miRNA-4262+si-NRG1組t值P值NRG1蛋白0.45±0.04 0.89±0.08a 0.92±0.09 0.56±0.05b 107.419 199.905細胞活性（OD490 nm）24 h 0.42±0.04 0.39±0.04 0.38±0.04 0.41±0.04b 1.875 0.000 48 h 0.74±0.07 0.54±0.05a 0.51±0.04 0.67±0.05b 36.835 0.154 72 h 1.18±0.09 0.71±0.07a 0.67±0.06 0.89±0.07b 90.349 0.000遷移細胞數目120.35±11.25 56.34±5.89a 52.67±5.28 91.25±8.25b 140.832 0.000侵襲細胞數目109.35±9.38 43.65±4.87a 40.98±4.07 82.47±7.89b 203.902 0.000 cyclin D1蛋白0.74±0.07 0.33±0.03a 0.31±0.03 0.62±0.06b 159.612 0.000 p21蛋白0.25±0.03 0.64±0.06a 0.65±0.07 0.37±0.04b 130.336 0.000 MMP2蛋白0.68±0.06 0.29±0.03a 0.27±0.03 0.56±0.05b 186.835 0.000 MMP9蛋白0.61±0.06 0.23±0.03a 0.21±0.02 0.52±0.05b 11.685 0.000

3 討論

肺癌是惡性腫瘤死亡的主要原因，約80%的肺癌患者為NSCLC[8]。NSCLC惡性程度較高，容易復發和轉移，多數患者確診時已處于晚期。目前，手術和化療等綜合治療方法雖然可在一定程度上減緩病情發展，但是對于延長患者的生存期仍需要進一步的研究[9-10]。因此，進一步了解NSCLC的發病機制，探究新的靶向治療方法對NSCLC的治療具有重要意義。

miRNA是一類含19～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，其通過與靶基因3'UTR區域結合降解靶基因的mRNA水平，參與體內多種生物學過程[11-12]。研究表明，miRNA-4262在急性髓系白血病患者的骨髓和血清中表達顯著上調，與miRNA-4262低表達的患者相比，miRNA-4262高表達患者的總生存時間和無復發生存時間均較短[13]。miRNA-4262在乳腺癌組織和細胞中的表達顯著上調，miRNA-4262通過靶向KLF6和KLF15促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲[14]。在肝細胞癌組織和細胞中miRNA-4262過表達，其通過激活核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）促進肝細胞癌細胞的增殖，抑制細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，NSCLC細胞株中miR-NA-4262的表達水平顯著高于正常肺上皮細胞，抑制miRNA-4262表達后，肺癌細胞株A549的增殖活性、侵襲和遷移細胞數目、cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP14表達水平均明顯降低，p21、p27表達水平均明顯升高，提示miRNA-4262在NSCLC中具有促進細胞增殖的作用，抑制miRNA-4262的表達可以抑制NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移，控制NSCLC的發展。

本研究還發現，NSCLC細胞株中NRG1的表達水平低于正常肺上皮細胞，其可能參與NSCLC的疾病進展過程。NRG1基因位于8pl2區域，在多種細胞中表達，且在多種惡性腫瘤中發揮抑癌基因的作用[16-17]。王友伢等[18]研究報道，NRG1在食管癌組織中的表達水平顯著低于正常食管組織，且與腫瘤的分化程度相關。NRG1在肺腺癌組織中低表達，其通過蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）和胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2途徑在人肺腺癌中發揮抑癌作用，上調NRG1的表達可抑制肺腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移[19]。樊新龍等[7]研究報道，NRG1在甲狀腺癌中低表達，過表達NRG1可抑制甲狀腺癌細胞MDA-3H和B-CPAP的增殖。本研究進一步證實，過表達NRG1后，pcDNANRG1組細胞中NRG1、p21蛋白表達水平均明顯升高，細胞活性、侵襲和遷移細胞數目、cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達水平均明顯降低，提示過表達NRG1可抑制NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移，與上述研究結果一致。

TargetScan生物信息學軟件預測結果顯示，miRNA-4262與NRG1具有特異性互補序列；雙熒光素酶基因報告、Western blot結果顯示，miRNA-4262可通過與NRG1的3'UTR區域直接結合負性調控NRG1的表達。為進一步驗證miRNA-4262靶向NRG1對NSCLC細胞的影響，本研究在穩定低表達miRNA-4262的基礎上沉默NRG1基因，結果顯示，細胞活性、侵襲和遷移細胞數目均升高，提示沉默NRG1基因可逆轉低表達miRNA-4262對NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用，進一步證實NRG1是miRNA-4262的靶基因。

綜上所述，miRNA-4262可靶向NRG1調控NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移，為NSCLC的靶向治療提供了潛在的治療靶點。