喉癌組織中Oct4、Nanog、β-catenin 的表達情況及臨床意義

李冬雷，張旭宇，肖躍華，劉偉，張美倫

保定市第二中心醫院1腫瘤科，2耳鼻喉科，河北 保定 072750

喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤，由于其發病隱匿、易轉移，發病率呈現逐年上升的趨勢。目前，喉癌主要的治療方法包括手術、放療和化療，但效果不佳。隨著分子生物學的快速發展，從分子生物學的角度尋找預測和治療喉癌的方法日益受到人們的關注。作為全能性或多能性干細胞標志物，八聚體結合蛋白4（octamer-binding protein 4，Oct4）在保持胚胎干細胞自我更新及全能性方面作用重大。Nanog是公認的腫瘤干細胞標志性基因，能夠抵抗放化療，調節腫瘤干細胞，去除或使該基因失活能夠抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[1]。β-連環蛋白（β-catenin）信號通路由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質組成，在調節胚胎發育和腫瘤發生及發展等生理、病理過程中起關鍵作用[2]。目前，關于Oct4和Nanog在喉癌組織中的表達及預后的相關研究相對較少。本研究采用免疫組織化學染色法檢測喉癌組織及癌旁組織中Oct4、Nanog和β-catenin的表達情況，探討Oct4、Nanog、β-catenin在喉癌發生發展過程中的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年1月至2013年9月保定市第二中心醫院收治的喉癌患者。納入標準：經術后病理證實為鱗狀細胞癌，且癌旁組織經病理檢查未發現腫瘤細胞。排除標準：術前接受過放療、化療等治療。依據納入和排除標準，本研究共納入71例患者。其中，男58例，女13例；年齡為35～84歲，平均年齡為（65.4±6.1）歲；聲門上型18例，聲門型36例，聲門下型17例；TNM分期：T1～2期32例，T3～4期39例；分化程度：高分化26例，中低分化45例；有淋巴結轉移37例，無淋巴結轉移34例。收集71例喉癌患者的喉癌組織和對應的癌旁組織（距喉癌組織邊緣＞0.5 cm）。

1.2 主要試劑

鼠抗人Oct4單克隆抗體、兔抗人Nanog多克隆抗體、鼠抗人β-catenin單克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，免疫組織化學染色試劑盒（SP-9000）、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色方法及結果判定

采用免疫組織化學染色方法檢測Oct4、Nanog和β-catenin的表達情況，取手術后經石蠟包埋的喉癌組織和癌旁組織切片（厚度為4 μm），分別經二甲苯、無水乙醇、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）脫蠟處理，使用3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶后，取出切片，使用PBS洗滌3次，每次5 min。采用微波修復法對抗原進行修復，將切片置于pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖液中，微波加熱至沸騰后進行冷卻，重復操作1次后用PBS清洗。清洗后取出切片，封閉10 min，加入一抗，4℃孵育12 h。孵育后洗滌，先后滴加生物素標記的二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素，4℃孵育20 min。孵育后再次洗滌，加入DAB顯色液染色5 min，之后經沖洗、復染、脫水、封片后置于顯微鏡下進行觀察。從每個切片中隨機挑選5個高倍視野并對陽性染色細胞數量進行統計。依據染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；依據陽性細胞所占百分比評分：＜5%為0分，≥5%且＜25%為1分，≥25%且＜50%為2分，≥50%且＜75%為3分，≥75%為4分。染色強度評分和陽性細胞所占百分比評分相乘，≤3分為陰性表達，＞3分為陽性表達。

1.4 隨訪

對喉癌患者進行門診或電話隨訪，隨訪時間為60個月，隨訪截止時間為2017年11月。觀察記錄患者隨訪期間的生存情況。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kappa檢驗進行一致性分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Logrank檢驗；采用Cox回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Oct4、Nanog和β-catenin表達情況的比較

Oct4陽性表達主要定位于細胞核，少量存在于細胞質；Nanog陽性表達主要定位于細胞核，少量表達于細胞質；β-catenin陽性表達主要定位于細胞膜。癌旁組織中Oct4、Nanog、β-catenin的陽性表達率分別為 21.13%（15/71）、15.49%（11/71）、22.54%（16/71），均明顯低于喉癌組織的45.07%（32/71）、52.11%（37/71）、49.30%（35/71），差異均有統計學意義（χ2=9.191、21.275、11.045，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征喉癌患者喉癌組織中Oct4、Nanog、β-catenin陽性表達率的比較

不同年齡、性別、吸煙情況、腫瘤類型的喉癌患者喉癌組織中Oct4、Nanog、β-catenin的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。中低分化、T3～4期、有淋巴結轉移的喉癌患者喉癌組織中Oct4的陽性表達率均高于高分化、T1～2期、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=5.457、4.495、4.262，P＜0.05）；中低分化、T3～4期、有淋巴結轉移的喉癌患者喉癌組織中Nanog的陽性表達率均高于高分化、T1～2期、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=7.488、1.633、5.035，P＜0.05）；中低分化、T3～4期、有淋巴結轉移的喉癌患者喉癌組織中Nanog的陽性表達率均高于高分化、T1～2期、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=5.633、5.189、5.117，P＜0.05）。（表1）

2.3 β-catenin與Oct4和Nanog表達的關系

一致性檢驗結果顯示，β-catenin和Oct4表達的一致性較好（Kappa=0.633，P=0.000），β-catenin和Nanog表達的一致性較差（Kappa=0.381，P=0.001）。（表 2）

表1 不同臨床特征喉癌患者喉癌組織中Oct4、Nanog、βcatenin的陽性表達情況（n=71）

表2 喉癌患者喉癌組織中β-catenin、Oct4和Nanog的表達情況

2.4 生存情況的比較

β-catenin陽性表達患者的5生存率為40.6%，低于β-catenin陰性表達患者的59.0%，差異有統計學意義（χ2=9.178，P＜0.05）；Oct4陽性表達患者的5年生存率為18.9%，低于Oct4陰性表達患者的85.3%，差異有統計學意義（χ2=30.037，P＜0.05）；Nanog陽性表達患者的5年生存率為25.7%，低于Nanog陰性表達患者的75.0%，差異有統計學意義（χ2=20.063，P＜0.05）。（圖1～圖3）

圖1 β-catenin陽性表達（n=35）和陰性表達（n=36）喉癌患者的生存曲線

圖2 Oct4陽性表達（n=32）和陰性表達（n=39）喉癌患者的生存曲線

圖3 Nanog陽性表達（n=37）和陰性表達（n=34）喉癌患者的生存曲線

2.5 喉癌患者預后影響因素的Cox 比例風險回歸分析

Cox比例風險回歸分析結果顯示，TNM分期、淋巴結轉移情況及β-catenin、Oct4和Nanog表達情況均是喉癌患者預后的獨立影響因素（P＜0.05）。（表3）

表3 喉癌患者預后影響因素的Cox比例風險回歸分析（n=71）

3 討論

喉癌是一種嚴重威脅患者健康的惡性疾病，主要表現為咳嗽、呼吸困難、吞咽困難、頸部淋巴結轉移等癥狀。目前，喉癌發病的病因尚不清楚，通常被認為是多種因素作用的結果，主要與吸煙、飲酒、性激素和輻射有關[3]。早發現、早診治對于減輕喉癌患者痛苦、提高患者生存率以及減少術后并發癥至關重要。

Oct4是POU5F1基因編碼的POU轉錄因子家族中的一員，在維持干細胞正常功能中具有重要作用。有報道稱，人類表達Oct4基因的成體干細胞是癌變起源的一種靶細胞，Oct4在腫瘤發生過程中發揮著重要作用[4]。湯夏冰等[5]研究發現，Oct4在喉癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，并且Oct4的表達情況與喉癌組織的分化程度有關，其可能在喉癌細胞的分化過程中發揮重要作用，影響喉癌細胞的遷移和侵襲能力。本研究結果表明，與癌旁組織相比，Oct4在喉癌組織中的陽性表達率增加，且其表達與喉癌組織的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移均有關，Oct4陽性表達患者的生存率低于陰性表達患者，提示Oct4參與喉癌的發生發展過程，有望作為喉癌治療的新靶點和喉癌患者預后的預測指標。

Nanog是一種維持胚胎干細胞自我更新和多能性的重要轉錄因子，在睪丸原位癌、胚胎性腫瘤以及精原細胞瘤中特異性高表達，Nanog的高表達是類干細胞全能性的侵襲前睪丸原位癌細胞的標志。近年來，研究者們對Nanog在體細胞實體瘤中表達情況的關注度日益增加。王華等[6]研究發現，宮頸癌組織中Nanog的表達升高，且其表達情況與病理分期和陰道切緣等臨床特征關系密切，可能作為預測、診斷宮頸癌及評估療效的指標。陳麗云等[7]研究發現，與卵巢良性腫瘤組織相比，卵巢上皮癌組織中Nanog的陽性表達率明顯升高，Nanog陽性表達與卵巢上皮癌的病理分級、國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期以及淋巴結轉移情況均有關，可能在卵巢組織的惡性轉變和細胞分化中發揮重要作用。本研究發現，Nanog在喉癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，且與喉癌組織的分化程度和淋巴結轉移有關，Nanog陽性表達患者的生存率低于陰性表達患者，且Nanog表達情況是影響喉癌預后的獨立危險因素，與相關研究結果一致[8]，提示Nanog可以作為喉癌診斷和治療的新靶點。

β-catenin由一條多肽鏈組成，在細胞內信號傳遞中扮演重要角色，其表達水平與細胞的惡性表型有關。研究發現，β-catenin在胃癌、口腔鱗狀細胞癌、肺癌等多種腫瘤中表達異常[9-11]。本研究結果表明，β-catenin在喉癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，且其表達與喉癌組織的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況有關，β-catenin陽性表達患者的生存率低于陰性表達患者，與相關研究結果一致[12]，提示β-catenin表達異常可能與喉癌細胞的侵襲、轉移有關，有可能為臨床早期診斷和評估喉癌提供參考依據。

β-catenin信號通路在生命體中廣泛存在，與動物胚胎發育、器官形成及腫瘤的發生、發展密切相關。在疾病狀態下，機體內環境發生改變，βcatenin信號通路中游離的β-catenin能夠進入細胞核，調節相關基因的表達[13]。Li等[14]研究發現，在非小細胞肺癌中，β-catenin與Nanog的表達呈正相關，且與患者預后不良有關，進一步通過免疫熒光染色發現，在A549和H23細胞表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號傳導時，Nanog表達和核β-catenin蛋白表達同時增加，而在β-catenin敲低的A549和H23細胞中加入表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）時，Nanog表達卻未增加，提示β-catenin能夠上調Nanog的表達，在非小細胞肺癌中共同發揮作用，是預后不良的重要標志物。Yong等[15]研究發現，在胃癌中，幽門螺桿菌通過Wnt/β-catenin信號通路上調Nanog和Oct4的表達，當Nanog和Oct4啟動子活性被上調后，β-catenin與這些啟動子結合，促進腫瘤干細胞樣特性。Ravindran等[16]研究發現，在口腔鱗狀細胞癌組織中，β-catenin、Oct4和Nanog的表達具有相同的變化趨勢，共免疫沉淀分析結果顯示，βcatenin與Oct4和Nanog存在相互作用，共同影響口腔鱗狀細胞癌的發生發展過程。本研究結果顯示，喉癌組織中β-catenin、Oct4和Nanog的表達均上調，β-catenin和Oct4表達的一致性較好，βcatenin和Nanog表達的一致性較差，說明β-catenin與Oct4可能存在相互作用，而β-catenin與Nanog之間的關系還有待進一步深入分析，此結果與上述有關學者的研究結果存在一定的差異，可能是因為樣本量和分析方法不同導致。

綜上所述，Oct4、Nanog和β-catenin在喉癌組織中表達異常，且與喉癌組織的分化程度和淋巴結轉移情況有關，提示三者可能參與了喉癌細胞的發展和轉移過程，其對喉癌的作用機制可能存在部分關聯，三者聯合檢測可作為較為理想的診斷方法，對指導喉癌的臨床治療及判斷患者預后具有一定的應用價值。