血漿EB病毒DNA定量監測對Ⅱ期鼻咽癌診療及隨訪的意義△

華麗，陳紹俊#，陳海輝，黃海欣，蒙以良，林展

1柳州市工人醫院腫瘤科，廣西 柳州 545005

2百色市人民醫院放療科，廣西 百色 533000

3玉林市第一人民醫院放療科，廣西 玉林 537000

復發轉移是鼻咽癌治療失敗的主要原因。早期診斷鼻咽癌復發轉移能把握最佳挽救性治療的時機。但傳統基于鼻咽鏡、計算機斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）等檢查的隨訪監測機制，并不能對鼻咽癌復發轉移做出及時的響應。血漿EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）-DNA定量檢測已在常規治療中被證實與鼻咽癌預后有關，是目前反映鼻咽癌診治及預后和監測價值相對肯定的生物學因素，而調強放療（intensity modulated radiation therapy，IMRI）模式下EBV-DNA載量是否還與鼻咽癌的預后有關則需要重新評價。本研究通過分析接受IMRI的Ⅱ期鼻咽癌患者治療及隨訪過程中血漿EBV-DNA定量水平動態變化，探討其在Ⅱ期鼻咽癌患者診斷、療效評價和隨訪監測中的臨床意義，擬為Ⅱ期鼻咽癌的生物分層提供一定依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2010年1月至2012年10月廣西醫科大學第四附屬醫院及區內多家三甲醫院收治的108例經鼻咽部活檢確診為Ⅱ期[1]鼻咽部低分化鱗狀細胞癌的患者為病例組。納入標準：①預期生存期＞6個月；②體力評分為0～2分；③中性粒細胞≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，血肌酐＜12 mg/L，總膽紅素、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶≤2.5倍正常參考值上限。排除標準：①無病理診斷；②復發轉移；③合并嚴重內科疾病。108例Ⅱ期鼻咽癌患者中，男62例，女46例；年齡15～73歲，中位年齡46歲。另外選取108例同時期在門診體檢的健康志愿者作為對照組。對照組與病例組患者按1∶1匹配，匹配條件：與病例組患者同種族、同性別，年齡與病例組患者發病年齡（以診斷時年齡為準）±3歲，無血緣關系，出生居住地域接近，血常規、肝腎功能及心電圖檢查各項指標均無明顯異常等。所有研究對象均對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究經過醫院倫理委員會批準。

1.2 治療方法

病例組患者均接受IMRI聯合或不聯合同期化療。順鉑同期放化療的方案：順鉑80 mg/m2靜脈滴注，于放療第1、22、43天進行。IMRI采用6 MV直線加速器，5次/周，具體劑量：鼻咽癌計劃靶體積（plan gross target volume nasopharynx，PGTVnx）70.06 Gy/31次，淋巴結計劃靶體積（plan gross target volume node，PGTVnd）70.06 Gy/31次，計劃靶體積1（plan target volume1，PTV1）66.03 Gy/31次，計劃靶體積2（plan target volume 2，PTV2）54.25 Gy/31次。

1.3 標本采集

所有研究對象均接受血漿EBV-DNA定量檢測。病例組患者每次采血3 ml，加入EDTA抗凝管中，2000 r/min離心 5 min，取 200 μl血漿于-20 ℃凍存備用。EBV-DNA的提取及擴增步驟：將凍存血漿置于室溫環境，嚴格按照EBV熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測試劑盒說明書進行DNA提取；將混合的PCR反應液在ABI 7300 PCR儀上進行基因擴增檢測，PCR反應條件：93 ℃預變性2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10個循環；93℃30 s，55℃45 s，30個循環。在治療的第1、2、4、6周及治療結束后1周對血漿EBVDNA進行定量檢測，評價近期療效，并對治療結束后1周血漿EBV-DNA陽性且獲隨訪的患者在第3、5年繼續進行EBV-DNA定量檢測，評估治療后3、5年的局部復發及轉移情況。對照組只采集1次外周血，采血方法與病例組相同。血漿EBV-DNA濃度計算公式：C=Q×（VDN/VPC）×（1/VEXT）。血漿DNA＞1×102拷貝/毫升判定為陽性。

1.4 隨訪

隨訪截至2017年10月，有5例失訪，隨訪率為95.37%（103/108）。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。計數資料采用例數、中位數（M）及率（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析診斷價值；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿EBV-DNA陽性檢出率的比較

治療前108例患者共檢出100例血漿EBVDNA陽性（92.59%），104例（96.30%）患者血漿中可檢出EBV-DNA，EBV-DNA的中位濃度為3.15×105拷貝/毫升。對照組EBV-DNA陽性檢出11例（10.19%）。治療前病例組患者血漿EBV-DNA陽性檢出率明顯高于對照組，差異有統計學意義（χ2=146.798，P=0.000）。動態監測EBV-DNA陽性患者的血漿EBV-DNA發現，42例患者在治療第1周開始EBV-DNA水平明顯下降，89例患者在治療第2周開始逐漸下降，至治療的6～7周大部分患者基本檢測不到EBV-DNA，治療結束后1周，94例患者檢測不到EBV-DNA，明顯低于治療前。8例患者在治療的第1～4周EBV-DNA無變化，但在治療結束前2周，也基本檢測不到。治療后病例組患者血漿EBV-DNA陽性檢出率（12.96%）明顯低于治療前，差異有統計學意義（χ2=137.387，P=0.000）。

2.2 血漿EBV-DNA定量與近期療效的關系

100例治療前血漿EBV-DNA陽性的病例組患者治療結束1周后評價近期療效，完全緩解（CR）87例，部分緩解（PR）9例，疾病穩定（SD）1例，疾病進展（PD）3例。CR組患者EBV-DNA陽性檢出率為3.45%（3/87），PR組患者EBV-DNA陽性檢出率為88.89%（8/9）。治療結束1周EBV-DNA陽性與EBV-DNA陰性患者近期療效比較，差異有統計學意義（χ2=12.748，P=0.008）。（表1、表2）

表1 EBV-DNA陽性患者治療前后血漿EBV-DNA水平與療效的關系（IU/ml，M）

表2 治療結束1周EBV-DNA陽性檢出情況與近期療效的關系[n（%）]

2.3 血漿EBV-DNA定量與遠期療效的關系

100例EBV-DNA陽性患者治療結束后繼續隨訪至復發轉移。治療結束后1周有14例患者EBVDNA檢出陽性，治療后第3年有10例患者復發轉移，其中局部復發4例，遠處轉移6例，血漿EBVDNA陽性患者8例，其中局部復發2例，遠處轉移6例，血漿EBV-DNA陰性患者2例；治療后第3年EBV-DNA陽性患者復發轉移率明顯高于EBVDNA陰性患者，差異有統計學意義（P＜0.01）（表3）。治療結束1周血漿EBV-DNA情況預測鼻咽癌患者3年復發轉移的ROC曲線的曲線下面積為0.922（95%CI=0.806～1.000，P=0.000），最優 cut off值為89拷貝/ml，其所對應的靈敏度和特異度分別為0.900、0.911（圖1）。治療后第5年有14例患者復發轉移，其中局部復發4例，遠處轉移10例，血漿EBV-DNA陽性患者11例，其中局部復發3例，遠處轉移8例，血漿EBV-DNA陰性患者3例；治療后第5年EBV-DNA陽性患者復發轉移率明顯高于EBV-DNA陰性患者，差異有統計學意義（P＜0.01）（表3）。治療結束1周血漿EBV-DNA情況預測鼻咽癌患者5年復發轉移的ROC曲線的曲線下面積為 0.948（95%CI=0.864～1.000，P=0.000），最優 cut off值為80拷貝/ml，其所對應的靈敏度和特異度分別為0.929、0.942（圖2）。

表3 治療結束1周EBV-DNA檢出情況與遠期療效的關系[n（%）]

圖1 治療結束1周血漿EBV-DNA 情況預測鼻咽癌3年復發轉移的ROC曲線

圖2 治療結束1周血漿EBV-DNA 情況預測鼻咽癌5年復發轉移的ROC曲線

3 討論

鼻咽癌為EB病毒相關惡性腫瘤，發病呈明顯區域聚集傾向，好發于中國東南部各省。惡性腫瘤分期治療原則是實現規范化治療的前提。對于Ⅱ期鼻咽癌，盡管各指南和規范均指出同步放化療是此類患者的治療選擇，但其對優先推薦的治療方案不盡相同，Ⅱ期鼻咽癌是否應接受輔助化療和誘導化療仍存在爭議，指南推薦未能達成共識。臨床Ⅱ期鼻咽癌包括 T2N0M0、T0～1N1M0以及T2N1M0三個亞組。長期隨訪資料顯示亞組生存存在差異[2-3]。然而目前現有的分期系統不能完全體現Ⅱ期鼻咽癌風險因素分層，通過臨床分期系統指導Ⅱ期鼻咽癌治療存在一定的局限性。

EBV與鼻咽癌的發生發展密切相關。通過采用PCR技術可在鼻咽癌患者血漿或血清中檢測到EBV DNA，證實外周血中EBV DNA來源于鼻咽癌腫瘤細胞。有學者應用熒光定量PCR技術分析鼻咽癌患者血漿EBV-DNA水平，顯示鼻咽癌患者血漿EBV-DNA陽性率（96%）明顯高于健康對照者（7%），同時DNA拷貝數（中位濃度：21 058拷貝/ml）和健康對照者（中位濃度：0拷貝/ml）比較，差異有統計學意義；并且晚期患者（中位濃度：47 047拷貝/ml）明顯高于早期患者（中位濃度：5918拷貝/ml）[4-5]。祝曉芬等[6]研究也表明初診、遠處轉移和局部復發的鼻咽癌患者血漿中游離EBV DNA檢出陽性率均明顯高于健康對照者和持續緩解的鼻咽癌患者（P＜0.01）。馬德佳等[7]研究表明，早期鼻咽癌患者血漿EBV-DNA診斷靈敏度與特異度分別為95.2%和97.6%，健康成人則分別為2.9%和0，差異均有統計學意義。本研究同樣顯示，與對照組相比，鼻咽癌患者血漿可檢測出更高水平的EBV-DNA，表明EBV-DNA可以作為鼻咽癌篩查及早期診斷有效的生物標志物，目前分期系統首次將EBV用于T0期鼻咽癌的診斷，臨床對于高度懷疑鼻咽癌者，即使鼻咽沒有發現確切腫瘤，但通過EBV和頸部淋巴結仍然可以定義為T0期鼻咽癌。

在近期療效方面，本研究顯示CR組治療結束1周EBV-DNA陽性檢出率為3.45%，PR組則為88.89%。PD組EBV-DNA陽性患者治療期間血漿EBV-DNA水平在治療第6周仍在較高水平，治療結束1周仍可檢測出。張倩等[8]在對156例局部晚期鼻咽癌患者治療結束后的療效評價中，同樣觀察到CR組與PR組患者治療8周的血漿EBV-DNA陽性檢出率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。而既往多個研究也表明治療結束后EBV-DNA檢出率與治療有效率相關，可以協助判斷療效，并能反映治療后殘余腫瘤負荷，成為預測鼻咽癌近期療效的一項客觀指標。

在遠期療效方面，本研究顯示治療結束1周EBV-DNA變化與Ⅱ期鼻咽癌患者的3年和5年復發轉移率有關，治療結束1周EBV-DNA預測3年復發轉移率的靈敏度和特異度以及5年復發轉移率的靈敏度和特異度分別為0.900、0.911和0.929、0.942，同時治療結束1周血漿EBV-DNA定量水平對預測3年和5年復發轉移率的準確度較高（ROC曲線下的面積均＞0.9）。張倩等[8]研究同樣顯示出治療8周血漿EBV-DNA定量水平對診斷鼻咽癌1、2年復發轉移率具有較高的靈敏度和特異度。因此對于治療后EBV-DNA檢出陽性者，需要進行更加密切的隨訪，包括縮短隨訪間隔時間或接受更全面的臨床和影像學檢查。Lo等[4]研究表明在腫瘤進展前6個月即可出現血漿EBV-DNA升高，提示血漿EBV-DNA較常規的臨床體檢與影像學檢查對鼻咽癌復發轉移的預測具有更高的靈敏度。同時馬德佳等[7]對初治274例鼻咽癌患者隨訪5年中發現，治療前血漿EBV-DNA高濃度表達者總生存率和無復發生存率均低于低濃度者，差異均有統計學意義。李宇紅等[9]對90例初治放療后隨診鼻咽癌患者治療前血漿EBV-DNA定量分析表明，EBV-DNA＜40 000拷貝/ml者22個月無瘤生存率明顯高于≥40 000拷貝/ml者（P＜0.05）。提示通過對鼻咽癌患者治療前血漿EBV-DNA定量分析，可以有效對初治鼻咽癌患者進行風險等級劃分，提高對早期疾病的風險識別能力，并且能夠篩選出需要用PET-CT尋找確切復發轉移灶的部分患者[10]。因此血漿EBV-DNA定量分析與治療前后的動態監測能夠反映和甄別出體內腫瘤生物學行為的差異，初始治療前和治療結束后EBV-DNA水平較高的患者往往具有更高的復發和轉移風險，腫瘤在生物學行為上表現更差。如若與分期相結合，有可能改變鼻咽癌患者亞組風險定義。目前臨床對Ⅱ期鼻咽癌的治療仍存有爭議，表現為對誘導化療和輔助化療各指南與規范意見不一致。Leung等[11]研究顯示，Ⅱ期鼻咽癌患者治療前血漿EBV-DNA低濃度與高濃度者5年生存率分別為90%和63%，前者生存率與Ⅰ期鼻咽癌患者更相近（92%，95%CI=83～100），而后者則差于Ⅲ期鼻咽癌（73%，95%CI=64～82）。Zhang等[12]通過Meta分析14項前瞻性和回顧性對照研究，評估治療前、中、后血漿EBVDNA及血漿EBV-DNA半衰期與生存預后的關系，并提出一個4級系統性風險分層模型，認為對于治療前血漿EBV-DNA＜40 000拷貝/ml的Ⅱ期鼻咽癌患者可能應重新修訂分期為Ⅰ期，并只需要接受單純根治性放療；而≥40 000拷貝/ml者則可能被重新劃分為Ⅲ期，應接受更積極的治療策略，例如新輔助化療+放化療加或不加輔助治療。如果Ⅱ期鼻咽癌患者治療中期EBV-DNA無法被檢測到，能夠被調整至Ⅰ期，如仍能被檢測到，則提示具有高復發轉移風險。因此未來對于Ⅱ期鼻咽癌通過納入EBV-DNA進行風險等級評估指導下的治療才更能體現個體化的治療。

本研究首次基于IMRT模式下從診斷、治療及隨訪監測對Ⅱ期鼻咽癌與EBV-DNA的關系進行評估，顯示血漿EBV-DNA對于預測Ⅱ期鼻咽癌近遠期療效均具有較高臨床意義。下一步可以考慮聯合檢測Ⅱ期鼻咽癌治療前的EBV-DNA定量水平以及更多有價值的預測因子，通過風險分層給予不同治療模式，探討對生存預后的影響。但需注意的是，不同地區鼻咽癌患者感染的EBV種類或感染率不同，而且可能與檢測方法也相關。此外腫瘤消退后患者EBV-DNA水平是否穩定，預測的靈敏度及特異度效能如何，均有待進一步研究及擴大樣本量以明確。