血清miR-125b、miR-142-3p表達與膿毒癥預后的關系及其預測價值

徐志育，謝曉紅，朱永，周忠義，雷振林

膿毒癥是一種由感染、創傷等損傷因素引發的全身炎性反應綜合征(SIRS)[1]，該綜合征在重癥醫學科(ICU)較為多見，因此ICU患者的病死率通常高于其他科室[2]。目前，關于膿毒癥的發病機制尚未完全明確，大多數學者認為其發病的核心為炎性反應失衡[3]，當機體受到創傷、感染等損傷時，機體的各種細胞和體液系統被激活，產生大量的炎性介質，炎性介質又會作用于各種炎性細胞，產生級聯放大效應，加重機體的炎性反應，導致全身炎性反應失衡，最終發展成全身多器官功能障礙[4]。因此，控制全身炎性反應失衡，有助于膿毒癥患者的治療和預后[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由內源性基因編碼的單鏈RNA，其長度為18～22個核苷酸，主要通過降解信使RNA(mRNA)或抑制翻譯過程調控轉錄后基因表達，從而參與發育、炎性疾病、膿毒癥和衰老等過程[6-7]。研究發現，miR-125b和miR-142-3p與炎性反應密切相關，可以通過多種途徑調控炎性因子的表達[8-9]。因此，現檢測患者血清miR-125b和miR-142-3p的表達，分析其與相關臨床指標和實驗室指標的關系，及其對膿毒癥患者的預后評估價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2019年10月海南省人民醫院重癥醫學科重癥監護室(ICU)住院的膿毒癥患者100例作為膿毒癥組，其中腹腔感染34例，肺部感染38例，顱內感染10例，泌尿系統感染18例。男43例，女57例，年齡25～83(61.43±20.52)歲，急性生理和慢性健康評分量表(APACHE Ⅱ)評分為(17.22±7.17)分，序貫器官衰竭估計評分(SOFA)為(7.25±3.51)分。另選取同期于醫院ICU住院的非膿毒癥患者90例作為對照組，其中腦出血35例，腦梗死42例，其他13例。男42例，女48例，年齡27～80(58.92±18.46)歲, APACHE Ⅱ評分為(15.96±5.63)分，SOFA評分為(6.52±3.75)分。2組患者性別、年齡、APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，患者或家屬對研究知情同意且簽署同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①符合2016年美國重癥醫學會和歐洲重癥醫學會聯合發布的膿毒癥Sepsis3.0診斷標準[10]；②年齡>18歲。(2)排除標準：①入院1 d內死亡者；②入院前使用激素藥物；③合并惡性腫瘤的患者；④患有慢性肝臟疾病、腎臟疾病和自身免疫性疾病的患者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 APACHEⅡ、SOFA評分相關指標檢測[11]：2組患者進入ICU后24 h內，根據APACHE Ⅱ的相關計算參數收集體溫、血鉀、血鈉等相應指標的最差值，并計算APACHE Ⅱ評分；按照SOFA的相關計算參數收集血小板、多巴胺、膽紅素等相應指標的最差值，計算SOFA評分。

1.3.2 WBC、PCT和CRP檢測：患者進入ICU 24 h內采集肘靜脈血10 ml，放置1 h后， 離心收集上層血清。其中5 ml血清使用全自動生化分析儀檢測白細胞總數(WBC)、降鈣素原(PCT)和C反應蛋白 (CRP)。另5 ml血清放置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.3 血清炎性因子檢測：將儲存在超低溫冰箱的血清取出，置于室溫融化，使用酶聯免疫吸附試驗法檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6，試劑盒均購自Abcam公司，所有樣品處理和操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3.4 血清miR-125b和miR-142-3p表達檢測： 使用血清RNA提取試劑盒(Life Technologies公司)提取血清總RNA，使用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific 公司)檢測總RNA濃度和純度，采用北京天根生化科技有限公司的RNA逆轉錄試劑盒將提取總RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR：反應體系20 μl，2 × qPCR Mix 10 μl、上下游引物各2 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 7 μl。反應過程：預變性 95℃、15 min， 72 ℃、34 s， 94 ℃、29 s， 60 ℃、34 s，重復循環40 次；溶解曲線 72 ℃、1 min。以U6作為內參基因，采用2-△△Ct法計算miR-125b和miR-142-3p的相對表達量，以表示目的基因表達水平。引物序列見表1。

表1 不同基因的引物序列

2 結 果

2.1 2組臨床資料比較 膿毒癥組WBC、CRP、PCT、TNF-α、IL-6、IL-1β、miR-125b和miR-142-3p水平高于對照組(P均<0.01)，2組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較差異無統計學意義(P均>0.05)，見表2。

表2 2組患者臨床資料比較

2.2 膿毒癥患者2亞組臨床資料比較 根據膿毒癥患者28 d病死情況將患者分為存活亞組(63例)和死亡亞組(37例)。存活亞組患者入院時APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、PCT、TNF-α、IL-1β、miR-125b和miR-142-3p水平均低于死亡亞組(P均<0.01)；而2亞組WBC、CRP和IL-6水平比較差異無統計學意義(P均>0.05)，見表3。

表3 2亞組患者臨床資料比較

2.3 miR-125b和miR-142-3p與膿毒癥相關指標的關系 Pearson相關性分析顯示，miR-125b與APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、CRP、PCT、TNF-α和IL-6呈正相關(P均<0.05)，與WBC和IL-1β無明顯相關性(P>0.05)；miR-142-3p與PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相關(P均<0.05)，與APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、WBC和CRP無明顯相關性(P>0.05)，見表4。

表4 miR-125b和miR-142-3p與膿毒癥相關指標的關系

2.4 miR-125b和miR-142-3p對膿毒癥患者的預后價值 繪制ROC曲線評估miR-125b和miR-142-3p對膿毒癥患者預后的預測價值，血清miR-125b的AUC為0.746(95%CI0.676～0.817)，最佳臨界值為1.74，敏感度和特異度分別為79.57%和72.26%，約登指數為0.518；血清miR-142-3p的AUC為0.685(95%CI0.609～0.760)，最佳臨界值為2.68，敏感度和特異度分別為68.03%和71.15%，約登指數為0.392，見圖1。

圖1 miR-125b和miR-142-3p對膿毒癥預測價值的 ROC曲線分析

3 討 論

膿毒癥是ICU危重患者死亡的主要原因之一，據統計，全球每年膿毒癥新發病例約3 150萬例，每年死亡例數達到530萬例[12]。有學者提出早期預測膿毒癥患者死亡風險，及時給予個體化治療具有十分重要的臨床意義[13]。現有生物標志物如IL-6、CRP、WBC和PCT是評價感染的指標，但這些指標在一些非感染性疾病中也升高，對于死亡風險的預測能力有限[14]。近幾年研究顯示，由于miR在血液中的穩定性強，化學結構簡單，因此，循環系統中miR用作生物標志物的性能可能優于其他血清標志物[15]。多項研究顯示miR-125b和miR-142-3p是某些炎性疾病的風險標志物[8, 9, 16]，并且miR-125b和miR-142-3p參與了膿毒癥的發病過程[17-18]，提示miR-125b和miR-142-3p可能作為膿毒癥的死亡風險標志物。

本次研究中，膿毒癥組患者血清WBC、CRP、PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯高于對照組，李愛林等[19]的研究也顯示，膿毒癥患者血清CRP和PCT水平高于健康成年人。本研究采用多項炎性因子指標，進一步驗證了膿毒癥是一種全身炎性反應綜合征，機體存在炎性反應失衡[20]，同時也檢測了血清中miR-125b和miR-142-3p表達水平，發現膿毒癥組患者血清miR-125b和miR-142-3p表達水平顯著高于對照組，Zhu[21]的研究也發現，miR-125b在膿毒癥組患者血清中表達水平顯著增加，上述研究均提示miR-125b和miR-142-3p與膿毒癥有關。有miR測序研究顯示，miR-125b是炎性疾病的潛在標志物[16]，本次研究發現，死亡亞組患者入院時血清miR-125b相對表達量高于存活亞組。ROC曲線結果顯示，血清miR-125b預測膿毒癥患者預后的AUC為0.746，最佳臨界值為1.74，敏感度和特異度分別為79.57%和72.26%,提示miR-125b也可以作為膿毒癥患者死亡風險增加的生物標志物。而Zhu[21]的研究中血清miR-125b預測膿毒癥患者預后的AUC為0.658，低于本次研究，可能是患者病情的嚴重程度不同及基礎疾病不同造成的。本研究還發現，死亡亞組患者入院時APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、PCT、TNF-α和IL-1β水平也顯著高于存活亞組，說明病情和感染越嚴重的患者預后越差。此外，miR-125b與APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、CRP、PCT、TNF-α和IL-6水平呈正相關，提示miR-125b可能是通過多種途徑促進機體炎性反應和器官功能障礙，具體機制可能是miR-125b和p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)相互作用，通過調節p38 MAPK/核轉錄因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路促進炎性因子的釋放[18]，因此miR-125b與TNF-α和IL-6呈正相關，以嚴重炎性反應為特征的膿毒癥患者血清miR-125b的表達水平也升高。另一方面，膿毒癥會誘發多種器官功能障礙和衰竭，而miR-125b可以促進心臟纖維化及成纖維細胞轉變成肌成纖維細胞，還可以引起急慢性肝功能衰竭[22-23]，因此以多器官功能障礙和衰竭為特征的膿毒癥患者血清miR-125b表達水平增加。

本次研究還發現，死亡亞組患者入院時血清miR-142-3p表達水平高于存活亞組，miR-142-3p表達與PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相關，提示miR-142-3p可能參與調控炎性因子的表達，其機制可能與Sirtuin1有關，研究顯示，miR-142-3p可通過Sirtuin1/NF-κB信號通路促進炎性因子的釋放[24]，膿毒癥動物模型研究顯示，miR-142-3p可能通過降低腺苷酸環化酶(adenylyl cyclase，AC)的表達促進炎性反應，進而調控TNF-α和IL-1β的表達水平[16]，且另外有研究顯示，miR-142-3p可以直接調控IL-6的表達水平[25]。但miR-142-3p與APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、WBC、CRP無明顯相關性，說明miR-142-3p與膿毒癥的關聯弱于miR-125b，經ROC曲線評估其預測價值，發現其AUC、敏感度及特異度均小于miR-125b，提示miR-142-3p表達雖然在膿毒癥患者中異常升高，但其預測膿毒癥患者預后的價值較miR-125b低，這可能是受到樣本量及遺傳因素的影響造成結果的偏倚。本研究因研究時間有限，尚未進一步探究miR-125b和miR-142-3p在膿毒癥發生發展過程中的機制，后續將擴大樣本量并做二者的聯合檢測以期提高對膿毒癥患者預后的預測價值，為臨床膿毒癥的治療提供依據。

綜上所述，膿毒癥患者血清中 miR-125b和miR-142-3p表達升高，且均與不良預后有關，miR-142-3p表達與PCT、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相關，其預測膿毒癥患者的價值較低，miR-125b表達與APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、CRP、PCT、TNF-α及IL-6均呈正相關，其對膿毒癥患者預后具有較好的預測價值。