黃芪多糖通過TLR4/NF-κB通路抑制COPD大鼠炎性反應誘導的平均血小板體積降低

曹亮，劉建華，馮平，趙建清

平均血小板體積(MPV)是檢測血小板活化的替代指標[1]。前炎性因子和急時相反應物產(chǎn)生過多可通過干擾巨核細胞功能，使骨髓釋放出小體積血小板。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由多種炎性細胞、炎性介質及細胞因子介導的慢性炎性反應性疾病，COPD急性加重(AECOPD)是導致患者住院治療和死亡的重要原因之一。以往研究發(fā)現(xiàn)[2]，AECOPD恢復期患者MPV減小，且減小程度與AECOPD病情嚴重程度相關。黃芪多糖(APS)是中藥黃芪的主要活性成分之一，對肺組織炎性反應損傷有保護作用[3]。ASP對抑制COPD炎性反應的研究尚不多見，現(xiàn)分析ASP抗炎程度與MPV變化的關系，為MPV能夠有效評估COPD病情嚴重程度提供依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：SPF級雄性SD大鼠60只，8周齡，體質量(200±20)g，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCKK(冀)2013-1-003。大鼠自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)1周，平均溫度25℃，相對濕度65%～70%，光照12 h。(2)藥物與試劑：烏拉坦(購自上海化學試劑廠)、青霉素(購自東北制藥公司)、鏈霉素(購自山東魯抗制藥股份有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司)， ELISA試劑盒(購自上海信帆生物有限公司)，人巨核細胞株Meg-01細胞(購自上海一研生物科技有限公司)。(3)儀器：臺式高速離心機(購自長沙湘銳離心機有限公司，型號 TG22-WS)、全自動血液分析儀(購自廈門海菲生物技術有限公司，型號 BC-3300CT)、醫(yī)用生物顯微鏡(購自云南遠錦光學儀器有限公司，型號 XSB)、LQS酶標儀(購自北京中西遠大科技有限公司，型號SP21-318C)、凝膠成像儀(購自上海嘉鵬科技有限公司，型號 ZF-288)。

1.2 實驗方法 2019年12月—2020年2月于河北北方學院附屬第一醫(yī)院實驗室進行實驗。

1.2.1 COPD模型大鼠制備與分組： 60只大鼠隨機數(shù)字表法分為6組，即空白對照組，模型組，黃芪多糖400、600、800 mg/kg組和潑尼松(6 mg/kg)組，每組10只。COPD大鼠造模方法參考文獻[4]：于第1日、14日實施麻醉后經(jīng)氣管注入脂多糖(LPS，1 g/L)200 μl，第2～28日(不含第14日)置于密封的煙室中，每日吸入香煙煙霧(含焦油19 mg、尼古丁1.2 mg)1次，每次持續(xù)吸入30 min。黃芪多糖各組與潑尼松組每天注入脂多糖或吸煙前給予不同劑量黃芪多糖及潑尼松灌胃；空白對照組、模型組平行給予生理鹽水灌胃。胸部X線攝片出現(xiàn)兩側膈肌下降、肋間隙增寬、肺野透亮度增加，表明COPD大鼠造模成功[5]。

1.2.2 骨髓巨核細胞培養(yǎng)與分組： 為進一步明確黃芪多糖促進骨髓巨核細胞成熟的作用是直接的，亦或是間接的，因此另取人巨核細胞株Meg-01細胞進行實驗，以促血小板生成素(TPO)為陽性對照，觀察黃芪多糖能否直接促進大鼠中骨髓巨核細胞的成熟。從液氮罐中取出具有晚期成熟性狀的人巨核細胞株Meg-01細胞(購自美國ATCC公司)，置于37 ℃水浴中快速解凍，然后加PBS于室溫下1 000 r/min離心5 min，PBS重懸洗滌細胞3次并離心除去PBS，細胞用改良RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/ml)重懸，輕輕吹打至單細胞懸液，再移至培養(yǎng)皿中置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將細胞懸液轉移到離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用新鮮培養(yǎng)基吹打成細胞懸液后進行分皿，加培養(yǎng)基到合適密度傳代細胞，選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。根據(jù)實驗需要，將對數(shù)期的Meg-01細胞分為6組[6]。(1)對照組：含10%胎牛血清的伊思柯夫改良培養(yǎng)液(IMDM)培養(yǎng)基。(2)黃芪多糖組：黃芪多糖100 mg/L+IMDM培養(yǎng)基。(3)白介素1β(IL-1β)組：IL-1β 20 μg/L+IMDM培養(yǎng)基。(4)白介素8(IL-8)組：IL-8 20 μg/L+IMDM培養(yǎng)基。(5)腫瘤壞死因子α(TNF-α)組：TNF-α 20 μg/L+IMDM培養(yǎng)基。(6)TPO組：TPO 50 μg/L+IMDM培養(yǎng)基。Meg-01細胞以1×105/ml的密度接種于24孔板，加入相應培養(yǎng)液，5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 大鼠骨髓巨核細胞采集與形態(tài)觀察： 將大鼠脫臼處死，迅速剝離雙側股骨，剪斷股骨兩端，在培養(yǎng)皿中用裝有 PBS 洗液的 1ml 注射器，向骨髓腔內(nèi)快速推入，反復沖洗骨髓細胞，直至股骨外觀呈白色時骨髓全部沖出。用1 ml空針頭將含有骨髓的液體過濾至離心管中， 2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，取下層骨髓沉淀迅速涂片。風干后瑞氏染色 5 min，流水沖洗，室溫晾干。每張骨髓片以直徑6 mm范圍內(nèi)細胞數(shù)目為基準，光鏡下觀察并計算全片巨核細胞數(shù)和產(chǎn)板巨核細胞數(shù)。

1.2.4 大鼠MPV測量： 對每只大鼠使用尾尖采血法取血液2 ml，固定動物并析出鼠尾，將鼠尾在45℃溫水中浸泡數(shù)分鐘，也可用二甲苯等化學藥物涂擦，使局部血管擴張。將鼠尾擦干，剪去尾尖，血自尾尖流出，讓血液滴入盛器或直接用移液器吸取。將血液于抗凝管中，采用BC 3000CT全自動血液分析儀(深圳邁瑞)測量血樣中MPV。

1.2.5 大鼠血清炎性因子檢測：大鼠腹腔注射25%烏拉坦麻醉，腹主動脈采血8 ml，1 500 r/min離心20 min，取血清。以酶標儀檢測血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平,嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.6 Western-blot檢測肺組織中Toll樣受體4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)蛋白表達：獲取大鼠肺組織細胞，用PBS洗滌3次，用試劑盒提取蛋白后，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離，分離的蛋白在200 mA下轉膜至PVDF膜上。轉膜完成后，4℃下用5%脫脂牛奶封閉膜過夜，一抗(1 ︰1 000 TLR4，1 ︰1 500 NF-κB，1 ︰1 000 β-actin)4℃孵育過夜，洗膜后換HRP標記Ⅱ抗室溫孵育2 h。將漂洗后的膜放入干凈的皿中，暗室中吸取等量發(fā)光試劑A液與B液并混勻，然后均勻澆注在PVDF膜蛋白面上，數(shù)秒后用凝膠成像儀分析，Image J軟件分析TLR4、NF-κB 灰度值。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測肺組織中炎性因子mRNA表達： 按照Trizol試劑說明書要求提取總RNA并通過逆轉錄—聚合酶鏈反應逆轉錄為cDNA，使用RT-PCR儀進行擴增，以GAPDH為內(nèi)參檢測肺組織中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA的相對水平。所有引物均由上海生工生物技術公司合成，見表1。檢測結果采用2-△△Ct法進行相對表達分析。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.8 血小板膜糖蛋白CD41(CD41)、血小板膜糖蛋白Ⅰba(GPIba)表達的測定：收集Meg-01細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌細胞并調(diào)整細胞濃度為1.0×106/ml。取細胞懸液各20 μl，PE-anti-human CD41試劑1 ︰10稀釋后加入到細胞懸液中，37℃溫箱中孵育30 min，加PBS至400 μl，流式細胞儀檢測CD41的表達。另取細胞懸液各50 μl，加入SE-2抗體2 μg/ml于37℃溫箱中孵育30 min，山羊抗小鼠IgG(H+L)FITC試劑1 ︰200稀釋后加入細胞懸液中，輕輕混勻，37 ℃溫箱中孵育30 min后加PBS至400 μl，流式細胞儀檢測GPIba。

2 結 果

2.1 各組大鼠表現(xiàn)特點比較 空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食、呼吸正常；模型組大鼠精神不振、反應遲鈍，食欲降低、體質消瘦，伴有咳嗽、哮鳴音、痰鳴音等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)；潑尼松組大鼠精神狀態(tài)、呼吸、飲食均得到改善；各黃芪多糖組隨劑量升高，大鼠病情緩解更加明顯，800 mg/kg時改善最為顯著。

2.2 各組大鼠骨髓巨核細胞及MPV比較 與空白對照組比較，模型組大鼠骨髓巨核細胞總數(shù)顯著增加，產(chǎn)板巨核細胞數(shù)量顯著降低，MPV顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖各組和潑尼松組大鼠巨核細胞總數(shù)減少、產(chǎn)板巨核細胞數(shù)顯著增加，MPV顯著升高(F=12.086、13.051、18.265，P<0.001)。與潑尼松組比較，黃芪多糖800 mg/kg組產(chǎn)板巨核細胞數(shù)、MPV差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1、表2。

2.3 各組大鼠血清炎性因子表達量比較 與空白對照組比較，模型組IL-1β、IL-8、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖各組和潑尼松組IL-1β、IL-8、TNF-α顯著降低(F=15.028、14.581、16.082，P均<0.001)。與潑尼松組比較，黃芪多糖800 mg/kg組血清炎性因子水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白水平比較 與空白對照組比較，模型組TLR4、NF-κB蛋白表達顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖各組和潑尼松組TLR4、NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與潑尼松組比較，黃芪多糖800 mg/kg組TLR4、NF-κB蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

表3 各組大鼠血清炎性因子水平比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與潑尼松組比較，cP>0.05

圖1 各組大鼠骨髓巨核細胞形態(tài)(鈣鹽染色，×400) 表2 各組大鼠骨髓巨核細胞及MPV比較

組 別n巨核細胞總數(shù)(個/mm2)產(chǎn)板巨核細胞數(shù)(個/mm2)MPV(fl)空白對照組1054.20±3.6816.20±2.557.67±0.49模型組1085.60±6.09a2.50±0.63a6.21±0.55a潑尼松組1058.70±5.16b15.30±3.05b7.52±0.38b黃芪多糖400 mg/kg組1071.90±5.39b5.70±2.56b6.48±0.40b黃芪多糖600 mg/kg組1066.02±3.66b10.80±2.53b7.02±0.36b黃芪多糖800 mg/kg組1061.11±4.97bc14.70±2.91bc7.22±0.41bcF值12.08613.05118.265P值<0.001<0.001<0.001

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與潑尼松組比較，cP>0.05

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與潑尼松組比較，cP<0.05

圖2 各組大鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達比較

2.5 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達量比較 與空白對照組比較，模型組IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖各組和潑尼松組IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達顯著降低(P<0.05)。與潑尼松組比較，黃芪多糖800 mg/kg組IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與潑尼松組比較，cP<0.05

圖3 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表達比較

2.6 人巨核細胞株Meg-01分化標記物CD41、GPIba表達量比較 與對照組比較，IL-1β組、IL-8組、TNF-α組巨核系Meg-01細胞CD41、GPⅠba的表達顯著下調(diào)，其中TNF-α下調(diào)幅度最大(F=21.620，P<0.001)；TPO組巨核系Meg-01細胞CD41、GPⅠba的表達上調(diào)(F=15.231，P<0.001);與對照組比較,黃芪多糖組細胞CD41、GPⅠba的表達差異無統(tǒng)計學意義(t=0.869，P=0.123)，見圖4。

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01圖4 各組Meg-01巨核細胞 CD41、GPⅠba的表達

3 討 論

平均血小板體積(MPV)是反映血小板活化程度的指標，在急性心肌梗死、高膽固醇血癥、糖尿病、高血壓和阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征等具有指導意義，已成為國內(nèi)外研究的熱點[7-9]。由于MPV的變化可反映感染、炎性反應、免疫等慢性病嚴重程度[10-11]，近年來MPV評估COPD病情嚴重程度的研究也逐漸增多[12]。COPD患者由于肺血管收縮、血流減慢，常存在缺氧、感染、酸中毒等癥狀，大量中性粒細胞和巨噬細胞聚集，使局部及全身炎性反應水平加重[13-16]。

肺主呼吸，朝百脈，匯聚氣血。氣虛、血瘀是引發(fā)肺病的重要病理基礎，肺氣虧虛是COPD病機之本。黃芪補氣升陽、利水消腫，其主要活性成分之一黃芪多糖，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制細胞分泌炎性因子的作用[17]，對LPS誘導的炎性反應有明顯抑制作用[18]。為探究黃芪多糖對COPD的改善作用，分別給予COPD大鼠黃芪多糖400、600、800 mg/kg灌胃，以潑尼松為陽性藥對照，結果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，給予黃芪多糖各組大鼠相關炎性因子IL-1β、IL-8、TNF-α及TLR4/NF-κB通路關鍵蛋白水平顯著降低。

IL-8、TNF-α在COPD炎性反應進程中發(fā)揮著重要作用[19-20]，是氣道炎性因子網(wǎng)絡的重要組成部分。IL-1β作為前炎性介質因子，一方面能夠激活免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖與分化；另一方面促進中性粒細胞溶體酶的釋放，產(chǎn)生大量氧自由基，促進IL-1、IL-6等炎性介質釋放，加重炎性反應。在COPD氣道及全身炎性反應中，IL-1β、IL-8、TNF-α基因轉錄與表達受上游NF-κB核轉錄因子的調(diào)節(jié)[21]。齊詠[22]、孫雪皎等[23]研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期重度COPD患者血清IL-8、TNF-α、NF-κB表達顯著高于空白對照組。生理條件下，NF-κB主要以p65/p50二聚體形式存在細胞質中與抑制蛋白I-κBα結合成無活性的三聚體。當細胞受到外界刺激，I-κB激酶被激活后，使I-κBα被磷酸化后發(fā)生泛素化而被蛋白酶體降解。由于I-κBα對p65/p50二聚體抑制作用解除，p65/p50二聚體NLS暴露而被轉入核內(nèi)，激活下游炎性基因。

為進一步明確黃芪多糖是否直接對骨髓巨核細胞有直接促成熟作用，取人巨核細胞株Meg-01細胞株進行實驗，以TPO為陽性對照，CD41和GPⅠba表達水平作為觀察指標。TPO是調(diào)節(jié)巨核細胞分化和生成血小板的關鍵因子[24]。CD41被認為是巨核細胞或血小板特有的標志[25]；GPⅠba是巨核細胞向血小板分化過程中，血小板表面逐漸增加的糖蛋白，對參與血小板黏附等生理功能起重要作用，對GPⅠba表達分析有助于識別巨核細胞的分化程度[26]。結果表明黃芪多糖先抑制炎性因子的表達，炎性因子再促進骨髓巨核細胞的成熟，表明如何有效抑制炎性因子是未來治療COPD的重要研究方向，同時炎性因子表達水平也是將黃芪多糖運用于臨床時評估療效的重要指標。

綜上所述，黃芪多糖通過抑制TLR4/NF-κB通路減輕COPD大鼠炎性反應并使MPV升高，而MPV隨著炎性反應劇烈程度的增加而降低，通過MPV可有效評估COPD炎性反應的嚴重程度。