天藍苜蓿含藥血清抗白血病K562細胞的體外實驗研究＊

段海婧 ，馬 駿 △

（1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

白血病(leukemia)是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，其克隆中的白血病細胞增殖失控，分化障礙，凋亡受阻，停止在細胞發育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生累積，并浸潤其他組織和器官，使正常造血受到抑制。白血病是中國十大高發惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤病死率中，其居第6位（男性）和第8位（女性），在兒童及35歲以下成人中則居第1位，在我國急性白血病發病率較高[1]。目前，白血病的治療仍以化療為主，但是因為大多數化療藥物十分昂貴且不具備靶向治療的特點，部分在治療白血病的同時還會產生嚴重的毒副反應。一些病人因為耐受不了藥物的毒副作用或因經濟原因而放棄治療。隨著人們對生存質量的重視，既有抗腫瘤作用，毒副作用又小且價格低廉的治療白血病的藥物，越來越受到人們的青睞。

天藍苜蓿，別名接筋草，以全草入藥，生于郊野曠地和路邊、田埂草叢中，多分布于東北、華北、西北、華中和西南各地。性甘、微澀，平，具有清熱利濕，涼血止血，舒筋活絡等功效。民間主要用于白血病，黃疸型肝炎，便血，痔瘡出血，坐骨神經痛；風濕骨痛，腰肌勞損等[2]。夏小軍的復方回生膠囊（天藍苜蓿、墓頭回等）在臨床用于治療小兒急性白血病具有顯著療效[3]，其中的主藥天藍苜蓿和墓頭回經體外藥敏試驗，具有抗急性白血病細胞的作用[4]。但有關天藍苜蓿抗急性白血病的藥理作用研究未見文獻報道。本文通過MTT法研究不同濃度的天藍苜蓿含藥血清對K562細胞增殖抑制的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

80-1型離心機 (金壇市恒豐儀器廠)；YZG/FZG系列真空干燥機 (杭州錢江干燥設備有限公司)；MCO-15AC培養箱(日本SANYOElectric Biomedical Co., Ltd.)；安全柜；BIOZYMEⅢ酶標儀(美國BIO RAD 公司)。

1.2 試劑

胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青鏈霉素 (武漢普諾賽生命科技有限公司)；1640培養基(賽默飛世爾科技有限公司)；MTT（Fluka公司）：二甲基亞砜(DMSO)。

1.3 藥材

天藍苜蓿于2015年7月采自甘肅省平涼市崆峒區，由甘肅中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室楊扶德教授鑒定為豆科苜蓿屬天藍苜蓿(MedicagolupulinaL.)地上部分。

1.4 動物和細胞

小鼠100只，體重20±2g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供；K562細胞，購自上海瓦蘭生物有限公司

2 方法

2.1 天藍苜蓿水煎液提取及配制

取天藍苜蓿地上部分干燥、粉碎。取藥物1000g，加 5000mL水煮沸 1h,去渣取汁，得水煎液3000mL，將殘渣加水5000mL煎煮45min，去渣取汁，得水煎液4100mL,合并兩次水煎液，過濾濃縮，置于4℃冰箱保存，備用。

配制高劑量，給藥時用蒸餾水調整濃度為1g/mL，為高劑量。

配制中濃度(0.5g/mL)天藍苜蓿100ml，量取高濃度(1.0g/mL)天藍苜蓿煎膏液50mL，準確用蒸餾水稀釋至100mL得到中濃度(0.5g/mL)天藍苜蓿煎膏液。量取中濃度(0.5g/mL)天藍苜蓿煎膏液40mL，用蒸餾水稀釋至80mL，得到低濃度(0.25g/mL)天藍苜蓿。

2.2 天藍苜蓿含藥血清的制備

小鼠100只，隨機分為空白對照組、天藍苜蓿水煎液高、中、低劑量組（實驗組），每組25只，禁食不禁水過夜后，空白對照組每日灌服等體積蒸餾水，實驗組每日分別灌服天藍苜蓿水煎液5、10、20 g/kg(劑量分別為臨床用量的 10、20、40 倍)，每日 2次(早晚進食前灌胃)，連續給藥5天，于末次灌胃1h后無菌條件下心臟穿刺取血，3000rpm離心15min分離血清，0.22μm微孔濾膜，56℃，30min滅活。將空白血清和含藥血清冷凍干燥成凍干粉，分裝標示后－20℃保存備用。

2.3 細胞培養

K562細胞為懸浮液培養于含10%的胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的1640培養液中，置于37℃、5%CO2的飽和濕度的條件下培養，1～2d更換培養液1次，取對數生長期細胞用于相關實驗。

2.4 用細自動細胞計數儀測定細胞存活百分率

取對數生長期的K562細胞,制備單細胞懸浮液并作適當稀釋，取20uL細胞懸液與細胞計數板上，在自動細胞計數儀上技術，測細胞成活率。并在光鏡下觀察細胞形態變化。

2.5 MTT法檢測天藍苜蓿含藥血清對細胞增殖的影響

取對數生長期的K562細胞，調整濃度為5.0×105/mL，每孔90uL接種于96孔板。實驗組加入天藍苜蓿高、中、低劑量含藥血清凍干粉1640培養液10uL使終濃度分別相當于在體高、中、低劑量濃度），對照組加入等體積DMSOK562細胞為對照組，以不含細胞的培養基作為空白對照組，每組設3個平行孔，置于37℃、5%CO2的飽和濕度的條件下培養 24、48、72h 后，加入 20μLMTT（5mg/mL）繼續培養 4h，每孔加入150μLDMSO，輕輕震蕩10min，待結晶物完全溶解后，于酶標免疫檢測儀上以測定波長為570nm波長處讀取各孔的吸光度（A）值。按公式計算細胞生長抑制率。

抑制率=｛（A陽性對照孔-A實驗孔/A陽性對照孔-A空白孔｝×100%

2.6 統計學分析

實驗數據采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，實驗結果采用±s表示

3 結果

1）未經藥物處理的細胞成活率98.6%

2）天藍苜蓿含藥血清對人白血病K562細胞凋亡形態的影響未經藥物處理的對照組。K562細胞多呈圓形，經不同濃度天藍苜蓿含藥血清處理后，均出現明顯凋亡形態，包膜皺縮，有泡狀突起及不規則凹陷，胞核染色質濃縮，固縮，濃染，斷裂成小團塊分散在胞膜周邊，以至形成凋亡小體。

3）天藍苜蓿含藥血清對人白血病K562細胞增殖的影響。不同濃度天藍苜蓿含藥血清作用K562細胞48h后，置于全自動連續光譜酶標儀在570nm處測定A值。按公式：細胞存活率%=（加藥細胞A/對照A）×100%，從而得出天藍苜蓿含藥血清對K562細胞作用的半數抑制濃度（IC50）為0.8mol/L。

不同濃度天藍苜蓿含藥血清作用K562細胞24、48、72h后，置于全自動連續光譜酶標儀在570nm處測定A值。見表1。

表1 天藍苜蓿含藥血清對白血病K562細胞增殖抑制率（%）

可見24h、48h和72h后，與對照組相比低、中、高三組隨劑量增加細胞存活率越低，有濃度依賴關系，各濃度間有顯著性差異（P＜0.05）。隨作用時間的延長，抑制作用增強，各時間段之間的差異有顯著性（P＜0.05），呈時間依賴關系。

4 討論

中醫認為白血病屬 “虛勞”、“熱勞”、“濕病”、“癖積”、“痰核”、“血證”之范疇，發病原因是由于人體正氣虛弱，受到邪毒的侵襲，內因外因相互作用而發病；七情內傷、饑餓勞累、房事過度，損傷精髓、肝脾及三焦，使陰陽氣血、臟腑功能失調，正氣內虛，復感六淫外邪或瘟毒而致病。過去，臨床上對于白血病的治療大都采用化療方法，其療效快，但副作用大，極易產生耐藥性，目前臨床多采用中藥與化療配合療法，中藥治療白血病的特點有：①中藥可增加化療敏感性；②中藥可對抗化療副作用，保護骨髓造血功能的恢復，防止化療藥物引起嚴重的骨髓抑制；③中藥可誘導白血病細胞凋亡，④中藥可誘導白血病細胞向正常細胞轉化等[5]，且中藥藥源廣泛，價格低廉，宜長期服用等優點，也是一般放、化療藥所不能相比的。因此，利用中藥、天然藥物抗白血病，配合化療和骨髓移植治療，己經日益受到廣泛重視。

K562細胞株系人慢性髓細胞白血病急變細胞株，費城染色體（Ph）陽性。在受到多種因素的誘導時，具有向紅系，單核系或巨核細胞分化的能力，是研究藥物作用、細胞凋亡、細胞分化、基因轉錄及蛋白表達的良好靶細胞[6]，該細胞廣泛用于抗白血病作用的研究如：吳東等[7]以K562細胞為實驗對象，研究小檗胺抗白血病作用；張啟國等[8]研究了藤黃酸對K562細胞的凋亡作用的誘導；易娟等[9]用K562細胞研究了小白菊內酯抗白血病作用誘導凋亡是化療藥物抗白血病的重要機制。細胞凋亡是一種在基因控制下的細胞主動死亡過程，以核酸內切酶活化后將DNA分解為180bp整倍數的片斷DNA為特征。形態學上表現為細胞起泡，核固縮。天藍苜蓿含藥血清作用明顯，要抑制腫瘤細胞的生長。本研究采用MTT法觀察了天藍苜蓿含藥血清對人白血病K562細胞增殖有抑制作用，其IC50值為0.8mol/L，顯示出天藍苜蓿含藥血清對K562細胞有殺傷作用。人白血病K562細胞經天藍苜蓿含藥血清處理后，細胞均出現明顯凋亡形態，胞膜皺縮，胞核固縮，濃染，斷裂成小團塊分散在胞膜周邊，以致形成凋亡小體。用不同濃度天藍苜蓿含藥血清處理白血病細胞株K562，24、48、72h后，發現呈時間和劑量依賴關系，因此，后續實驗建議使用高劑量。