廣西典型高砷區蜈蚣草根圍叢枝菌根真菌多樣性研究

蔡榕樹，王艷，孟德凱，趙寧寧，顧明華，王學禮*

1.廣西大學農學院/廣西農業環境與農產品安全重點實驗室，廣西 南寧 530004；2.廣西農業科學院生物技術研究所，廣西 南寧 530007

砷污染是中國突出且亟待解決的環境問題，其污染現狀十分嚴峻（史振環等，2015）。廣西南丹縣砷總儲量和采出量均居全國前列，砷渣存量2.7×105t，占地面積高達4.1×105m2，導致大范圍的土壤砷污染，農產品安全出現問題，威脅人類生命安全，砷污染治理刻不容緩（Sarwar et al.，2017；胡志剛等，2018）。植物修復技術因具有經濟有效、生態協調、環境友好等特點而頗受青睞（段志斌等，2016），蜈蚣草（Pteris vittataL.）是砷超富集植物，具有生長快、生物量大、地理分布廣、適應性強的特點，在砷污染環境的修復方面具有良好的應用前景（陳同斌等，2002），但如何提高蜈蚣草的修復效率是當前面臨的主要問題。許多研究表明叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）可以提高蜈蚣草的生物量及對砷的吸收轉運，提高其在中輕度砷污染土壤上提取效率（趙寧寧等，2017）。搞清楚礦區特別是高砷礦區及周邊蜈蚣草根區土壤AM真菌的資源狀況，可為篩選出促進蜈蚣草生長及砷吸收的優良AM真菌菌株打下基礎。

針對AM真菌資源調查及多樣性研究方面國內已有報道。李東偉（2012）、康前（2018）在礦區植物根際中均發現了較高的AM真菌孢子密度和物種豐度，在高濃度重金屬環境中，AM真菌與植物依舊可以形成良好共生關系。且但多樣性調查的對象主要為當地常見的優勢植物如硬毛南芥（Arabis hirsuta），白檀（Symlocos paniculata）、倒掛刺（Rosa longicuspis）等植物根區的AM真菌，國內對砷污染區AM真菌資源多樣性調查鮮見報道，對于高砷地區蜈蚣草-這種特殊的超富集植物根區的 AM 真菌物種豐度、多樣性等尚不清楚。因此本研究對廣西南丹縣砒霜廠舊址周邊地區蜈蚣草根圍土壤中AM真菌的多樣性及群落組成進行調查，以期明確蜈蚣草根區AM真菌資源狀況，研究結果將為南亞熱帶地區優良AM真菌菌株的篩選、重金屬污染土壤的植物-微生物聯合修復提供指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

采樣地點位于廣西南丹縣砒霜廠舊址及周邊地區。屬于屬亞熱帶季風氣候，年均氣溫16.9 ℃，年均降水量1400 mm左右。2017年6月在砒霜廠舊址及周邊地區選取5個樣地采集蜈蚣草系及其根圍土壤。從樣地1—5的海拔高度分別為802、517、567、456、462 m。樣地1（S1）為對照樣地，位于距砒霜廠舊址58 km的上風向區域，蜈蚣草長勢良好。樣地2（S2）位于三宜尾礦庫舊址，蜈蚣草長勢良好，根際土壤伴有少量碎石。樣地3（S3）位于大福樓尾礦庫，樣地4（S4）位于芭林尾礦庫舊址，樣地5（S1）位于灰樂尾砂堆，這3個樣地土壤中的砷濃度依次升高，雖然蜈蚣草長勢良好，但植株較矮小，根際土壤伴有較多砂礫。每個樣地3個重復，3個重復之間兩兩相距約50 m，每個重復隨機選取3株相距3—5 m且長勢良好的蜈蚣草，去掉地表大塊砂石和其他雜物，用酒精消毒過的小鏟沿宿主植物周圍向下挖，采集土層深度為 0—20 cm范圍的根系和根圍土樣約500 g，每個重復的根土樣混合，封口標記。根樣用自來水洗凈保存在FAA固定液中用于測定AM真菌侵染率。根圍土風干后過2 mm篩用于土壤理化性質測定、孢子分離、孢子密度統計和AM真菌鑒定。

1.2 理化性質測定

根據《土壤農化分析》（鮑士旦，2008）中所述方法測定土壤基本理化性質：土壤pH值采用酸度計（梅特勒-托利多SevevMulti型pH計）進行測定；土壤全氮采用半微量凱氏法測定；全磷采用NaOH熔融-鉬銻抗比色法測定；全鉀采用NaOH熔融-火焰光度法測定；土壤As總量、有效態砷含量和蜈蚣草植株As含量采用王水消解-氫化物發生原子熒光光譜法（HG-AFS，AF-610A原子熒光光譜儀，北京瑞利儀器公司）測定。

1.3 AM真菌侵染率測定

蜈蚣草根系染色處理：取出保存在 FAA固定液中的根系，用自來水沖洗，剪成0.5—1.0 cm的根段，放入10 cm帶塞試管中，加20% KOH溶液，90 ℃恒溫水浴1 h。去掉堿液，用自來水沖洗根段，加新配的堿性雙氧水（3 mL氨水、30 mL 10% H2O、567 mL去離子水）室溫下45 min，用自來水沖洗根段，加2% HCl溶液酸化5 min，去掉酸液后滴加5%醋酸墨水溶液（95 mL食醋、5 mL北京牌藍黑墨水）于90 ℃恒溫水浴30 min，倒掉染液，加清水浸泡過夜。挑選100條大小相近的根段制片，在顯微鏡下鏡檢，采用根段法進行侵染率（Ri）測定（Biermann et al.，1981）：

式中，I0表示沒有被侵染的總根段數，I1表示侵染率為10%的總根段數，I2—I10依次類推。

1.4 AM真菌孢子分離與密度測定

用濕篩傾析法分離AM真菌孢子。取25 g風干土樣置于大燒杯中，加500 mL水，攪拌均勻，靜置10 s左右，過3層篩（0.8—0.25—0.038 mm）保留下層篩面物；用清水反復沖洗下層篩面物，將篩子上的殘留物收集于直徑10 cm，底部標有小方格的培養皿中。在體視顯微鏡下統計每克風干土樣中所含的AM真菌孢子數量，測定孢子密度（王幼珊等，2012）。

1.5 AM真菌孢子形態學鑒定

將經過濕篩傾析法分離的孢子進行制片，顯微鏡下觀察孢子形態和大小、孢子的聚集方式、孢壁結構以及連孢菌絲特征，參考《VA菌根真菌鑒定手冊》（Schenck et al.，1990）、國際AM真菌保藏中心（INV AM）和《中國叢枝菌根真菌資源與種質資源》（王幼珊等，2012）以及最新分類系統等的鑒定方法，對AM真菌進行種屬鑒定及分類。

1.6 統計分析方法

通過分析AM真菌的孢子密度、分離頻度、相對豐度、物種豐度、香農-威納指數等來揭示AM真菌的多樣性情況。

孢子密度（Spore Density，SD）：

式中，m表示土壤質量；N表示孢子個數。

分離頻度（Frequency，F）：

式中，St表示AM真菌某屬或種出現的次數；n表示土樣個數。

物種豐度（Species Richness，SR）：

式中，S表示AM真菌種類數目；St表示土樣樣本總數，即50 g蜈蚣草根際土壤樣本中AM真菌的種類數。

相對豐度（Relative Abundance，RA）：

式中，NS表示AM真菌某屬或某種孢子數；Nt表示AM真菌總孢子數。

Shannon-Wiener指數（H）：

式中，S指某樣地中AM真菌的種數；Pi指某種AM真菌的孢子數占該樣地所有孢子數的百分比。

實驗數據的處理以及圖表等由Microsoft Excel 2013完成，由SPSS 17.0統計軟件進行數據統計，采用Duncan檢驗法進行多重比較檢驗處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 樣地土壤及蜈蚣草的理化性質

如表1所示。從S1—S5土壤總砷含量呈遞增趨勢，土壤有效態砷含量也呈同樣遞增趨勢。不同樣地的土壤pH有較大差異，S2 pH為5.11，是強酸性土壤，除S2外的樣地土壤呈為堿性或弱堿性。S2全氮含量顯著高于其他4個樣地。樣點S5全磷和全鉀含量均最高；樣點 S1全磷和全鉀含量均最低。砷污染樣地的蜈蚣草砷含量顯著高于對照樣地，整體上隨著土壤砷污染濃度的升高而升高。

2.2 AM真菌的侵染狀況及孢子密度

2.2.1 AM真菌的侵染狀況

如圖1所示，不同樣地間，蜈蚣草菌根侵染率有較大差異，其中樣地1和樣地5侵染率較高，分別為76.60%和82.00%；其次為樣地2和樣地4，侵染率依次為28.67%和20.67%；樣地3侵染率最低，僅為 16.67%。從樣地 1—5，菌根侵染率先降低后升高。

2.2.2 AM真菌孢子密度

如圖2所示，不同樣地間孢子密度差異較大，樣地4孢子密度最高，為12.98 ind·g-1，依次是樣地 2：6.56 ind·g-1、樣地 3：3.87 ind·g-1、樣地 1：2.72 ind·g-1，樣地 5 孢子密度最低，僅為 0.68 ind·g-1。樣地1—4孢子密度分別是樣地5孢子密度的4.00、9.65、5.69、19.09倍。

2.3 AM真菌的形態學鑒定及樣地分布

2.3.1 AM真菌孢子形態學分類

圖1 不同樣地蜈蚣草侵染率（Ri）Fig.1 The infection rate of Pteris vittata L.in different sites（Ri）

圖2 不同樣地蜈蚣草根圍土壤AM真菌的孢子密度（SD）Fig.2 Spore density in rhizosphere soil of Pteris vittata L.in different sites (SD)

如表2所示在采集的所有土壤樣品中，共分離鑒定出2目3科4屬10種AM真菌。其中7種屬于球囊霉屬Glomus，分別為聚叢球囊霉G.aggrega、白色球囊霉G.albidum、沙荒球囊霉G.deserticila、黃孢球囊霉G.flavisporum、團集球囊霉G.glomerulatum、網狀球囊霉G.reticulatum和地表球囊霉G.versiforme。1種屬于管柄囊霉屬Funneliformis，為縮球囊霉F.constricum。1種屬于近明囊霉屬Claroideoglomus，為近明球囊霉C.claroidem。1種屬于盾巨孢囊霉屬Scutellospora，為黑盾聚孢囊霉S.nigra。

表1 樣地土壤及蜈蚣草的理化性質Table 1 Soil and Pteris vittata L physicochemical properties of sites

表2 南丹蜈蚣草根圍AM真菌形態學多樣性Table 2 Morphological diversity of AM fungi in Pteris Vittata L.root area of nandan

2.3.2 蜈蚣草根圍土壤AM真菌分布狀況

不同樣地蜈蚣草根圍土壤中AM真菌的分布情況見表3。在分離鑒定出的10種AM真菌種中，近明球囊霉、團集球囊霉和地表球囊霉分離頻度最高，為100.00%。聚叢球囊霉、縮球囊霉、沙荒球囊霉、黃孢球囊霉和網狀球囊霉分離頻度最低，均為 20.00%。其中聚叢球囊霉和縮球囊霉為樣地 2的特有種，沙荒球囊霉、黃孢球囊霉和網狀球囊霉為樣地4的特有種。

同一AM真菌物種在不同樣地相對豐度有較大差異。近明球囊霉在樣地1、樣地2和樣地5均有較高的分布，分別占樣地1、樣地2和樣地5的32.35%、28.46%和35.29%；近明球囊霉在樣地3和樣地4有較低的分布，分別占樣地3和樣地4的8.97%和4.64%。

圖3 孢子形態圖Fig.3 The spore morphological

表3 不同樣地蜈蚣草根圍土壤中AM真菌的分布情況Table 3 AM fungi’s distribution in rhizosphere soil of Pteris vittata L.in different sites

團集球囊霉在樣地3和樣地4有較高的分布，分別占樣地3和樣地4的47.59%和29.79%；團集球囊霉在樣地1、樣地2和樣地5均有較低的分布，分別占樣地1、樣地2和樣地5的13.24%、8.94%和7.84%。不同樣地間相對多度最高的AM真菌也是不同的。近明球囊霉在樣地1和樣地2有最高的分布，為樣地1和樣地2的優勢種；團集球囊霉在樣地3和樣地4有最高的分布，為樣地3和樣地4的優勢種；地表球囊霉在樣地5有最高的分布，為樣地 5的優勢種。黑盾聚孢囊霉在不同樣地間均具有較低的分布，分別占樣地2和樣地4的0.81%和0.62%。

2.3.3 蜈蚣草根圍土壤AM真菌多樣性

如圖4所示，樣地2和樣地4物種豐度最高，均為4.33；其次為樣地1和樣地3，物種豐度分別為4.00和2.67；樣地5物種豐度最低，為2.00。樣地2和樣地4的物種豐度是樣地5物種豐度的2.17倍。

Shannon指數反映樣地AM真菌多樣性狀況，數值越大，多樣性越高。如圖 5所示，樣地 1的Shannon指數最高，為1.21；其次為樣地4、樣地2和樣地3，Shannon指數依次為1.18、1.02和0.81；樣地5的Shannon指數最低，為0.66。除樣地4外，樣地1—5 Shannon指數依次降低。

圖4 不同樣地蜈蚣草根圍土壤AM真菌的物種豐度Fig.4 Species Richness of AM fungi in rhizosphere soil of Pteris vittata L.in different sites

圖5 不同樣地蜈蚣草根圍土壤AM真菌的Shannon指數Fig.5 Shannon Index of AM fungi in rhizosphere soil of Pteris vittata L.in different sites

3 討論

本研究所調查的5個不同程度砷污染樣地中的蜈蚣草均能被AM真菌侵染，分離出AM真菌4屬10種，但與Schneider et al.（2013）在巴西砷污染土種分離出6屬23種相比，AM真菌的物種豐度相對較低。這是采用單一宿主植物蜈蚣草作為研究對象的緣故，因為AM真菌對宿主植物具有一定的選擇性（包玉英，2004），宿主植物多樣性在一定程度上決定了AM真菌的多樣性（何斐，2016）。同時重金屬污染土壤中的AM真菌物種多樣性水平相對較低（Khan，2001）。

本研究分離的10種AM真菌中，球囊霉屬7種，管柄囊霉屬1種，近明囊霉屬1種，盾巨孢囊霉屬1種，球囊霉屬占各個土壤樣本的75.31%—99.80%。球囊霉屬是該調查區域的優勢屬，這與 Wei et al.（2015）在銻污染地區苧麻根區土壤的AM真菌多樣性調查結果一致。這一結果可能的原因是球囊霉屬為AM真菌類型最大的群體，生活范圍較寬，可以形成一個龐大的菌絲網絡系統，在脅迫環境下重建菌絲網絡能力強，對環境脅迫有更強的適應性（Providencia et al.，2005；Wu et al.，2009）。相較于其它AM真菌僅能通過孢子繁殖，球囊霉屬AM真菌可以通過菌絲片段和菌根根段繁殖（Hassan et al.，2011），更高的產孢能力以及更強的侵染植物的能力提高了其繁殖能力，提高了球囊霉屬AM真菌在重金屬脅迫環境下的競爭力，促進根外菌絲在重金屬污染土壤中快速生長（Daniell et al.，2011）。

一般認為，植物根圍土壤中AM真菌的物種多樣性與孢子密度應是一致的，在重金屬污染嚴重的礦區，植物根區土壤中AM真菌的孢子密度與物種豐度之間也表現出了這種相關性，即孢子密度值較大的土壤，其物種豐度也較高（肖艷萍等，2008）。本研究的侵染率結果是 S5的侵染率最高，為84.00%，但其孢子密度僅為0.68 ind·g-1，遠低于其他4個樣地；同時S5樣地的物種豐度和物種多樣性也最低，分別為2.00和0.66。侵染率高，但孢子密度低是因為一定量的土壤重金屬雖不能抑制AM真菌與植物形成AM真菌共生體，但對AM真菌的產孢能力具有明顯的影響（梁昌聰等，2007）。高濃度的砷阻礙了AM真菌的生長繁殖，只有少數抗壓能力較強菌種的孢子可以抵抗這個不利因子從而在土壤中存活，如本研究結果中的近明球囊霉、地表球囊霉等，這部分優勢AM真菌的孢子具有很強的保護機制和外部菌絲的產生和更新能力，可以適應高濃度的重金屬環境（Patricia et al.，2016），菌絲的快速生長更新能力也使得其具有更高的侵染率。S1中總砷和有效態砷含量都很低，所以推測蜈蚣草根系侵染最高主要受土壤磷影響，因 S1土壤中的全磷為0.45 g·kg-1，遠低于其他4個樣地，而低磷可以刺激AM真菌孢子萌發和菌絲生長從而促進 AM 真菌的侵染（張淑彬等，2017）；同時S1樣地的孢子密度最低可能也受到高海拔的影響，S1的海拔為802 m，顯著高于其他4個樣地（S2—S5海拔高度為462—567 m），海拔升高會影響AM真菌的生長和產孢，明顯低AM真菌孢子密度（Gai et al.，2012）。

AM真菌對環境的適應能力很大程度決定了它的物種豐度及物種多樣性。除S4之外，S1—S5的物種豐度與多樣性總體呈下降趨勢，S4的物種豐度和多樣性分別為4.33和1.21，為S5的2倍左右，孢子密度是5個樣地中最高的，為6.56 ind·g-1。這可能與S4的孢子形態有關，AM真菌孢子的形態差異也影響孢子對砷污染的適應能力。S4的孢子如黑盾巨孢囊霉、沙荒球囊霉等顏色深或表面紋飾豐富的孢子多，5個樣地中，團集球囊霉和地表球囊霉等適應性較強的菌種分離頻度均達到了100%，相對豐度更高，顏色深、表面網紋間隔致密的AM真菌對砷污染的有更強的抵御能力，顏色深的AM真菌孢子黑色素含量高，砷濃度高的樣地中團球囊霉、地表球囊霉和縮球囊霉的AM真菌孢子的顏色相對砷含量低的樣地偏深，表面網紋更密，對其在礦區污染環境下的生存有利，網紋間隔致密的特征更有利于其抵御外界污染物的入侵，減少對其的損害，從而使AM真菌孢子具有更高的活力（李華健等，2019）。

4 結論

不同程度砷污染土壤中生長的蜈蚣草均能被AM 真菌侵染，隨著砷濃度的增加物種多樣性總體呈下降趨勢。無污染土壤中的AM真菌侵染率和孢子密度主要受土壤磷和海拔的影響。低磷促進孢子萌發和菌絲生長，從而提高侵染率，而海拔升高會導致孢子密度降低。但隨著土壤砷污染水平的增加，砷濃度逐漸成為主要影響因子，使侵染率上升，孢子密度下降。孢子密度和物種豐富的變化趨勢一致。

共分離出的4屬10種AM真菌，管柄囊霉屬、近明囊霉屬、盾巨孢囊霉屬各1種，其余7種均為球囊霉屬，球囊霉屬是該調查區域的優勢屬。AM真菌孢子的形態直接影響的其適應能力，顏色深、表面網紋間隔致密的AM真菌抗逆性更好，近明球囊霉、團集球囊霉和地表球囊霉等適應性較強的菌種分離頻度達到了100%，相對豐度也相對較高。