黃豆醋浸過程中成分及其抗氧化性的變化研究

孫 瑤， 樊偉康， 李國央， 楊世浩， 任曉莉

(太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008)

黃豆，中國各地均有栽培，亦廣泛栽培于世界各地，是重要的農(nóng)產(chǎn)品之一。黃豆?fàn)I養(yǎng)全面，富含有大量的不飽和脂肪酸，多種微量元素、維生素及優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其營養(yǎng)及保健功效深受關(guān)注。山西老陳醋選用優(yōu)質(zhì)五谷經(jīng)蒸、酵、熏、淋、曬釀就而成，素有天下第一醋的盛譽(yù)。食用以醋浸泡的食物對高血壓、冠心病、糖尿病、肥胖癥、感冒等有輔助療效，并有延緩人體衰老的作用。醋豆以整粒黃豆作為原料，經(jīng)食醋浸漬而成，它集合了黃豆和食醋的營養(yǎng)和保健作用。陳繼承等[1]研究醋豆液加工過程中主要成分轉(zhuǎn)化及其抗氧化活性變化的結(jié)果表明，醋豆液中β-葡萄糖苷酶活性隨浸泡溫度上升而下降，隨浸泡時間和比例增加而升高，在一定浸泡時間內(nèi)(30 d)，蛋白質(zhì)含量增加2.21倍，總酸下降27.75%，還原糖增加10.97倍，多酚上升8.37%，DPPH自由基清除率上升1.26倍，半數(shù)自由基清除率(IC50)下降78.23%，總抗氧化能力上升1.88倍。Madgi等[2]將刀豆浸泡過夜，也發(fā)現(xiàn)單寧含量有所提高。但關(guān)于黃豆在醋浸過程中營養(yǎng)成分及其生物活性變化的相關(guān)信息較為缺乏，本實(shí)驗(yàn)旨在發(fā)現(xiàn)不同食醋浸泡的黃豆的蛋白質(zhì)、多酚含量及其抗氧化性變化規(guī)律并進(jìn)一步研究醋浸時間對主要成分含量和抗氧化性的影響，最后分別進(jìn)行相關(guān)分析，為醋浸黃豆食品的功效性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃豆；東湖陳醋，山西老陳醋集團(tuán)有限公司，總酸：3.5 g/100 mL；東湖白醋，山西老陳醋集團(tuán)有限公司，總酸：3.5 g/100 mL；考馬斯亮藍(lán)G-250；牛血清蛋白，生工上海有限公司；福林酚試劑、Na2CO3、FeSO4、水楊酸、H202、NaNO2、對氨基苯磺酸、N-1-奈乙二胺鹽酸鹽、磷酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)等。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式高速冷凍離心機(jī)TGL18M，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計JH752，上海菁華科技儀器有限公司；電子天平FA2104B，上海越平科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋HH-3A，金壇市城西騰輝實(shí)驗(yàn)儀器廠；磁力攪拌器78-1，常州國華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃豆的預(yù)處理

在室溫下，稱取等量的新鮮黃豆分別浸泡在1 000 mL的陳醋、白醋中，取未浸泡的黃豆20粒并在浸泡1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31 d后各取樣20粒，取出的樣品用研缽粉碎后放置在燒杯中，加入適量石油醚進(jìn)行脫脂過夜，脫脂完成后回收石油醚，將樣品抽濾烘干成脫脂豆粉并密封置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 可溶性蛋白的提取及含量測定

稱取0.2 g脫脂豆粉放入燒杯中并加入5 mL、50 mmol/L、pH=7.8的Tris-HCl緩沖液，低溫攪拌提取30 min，然后放入5 mL離心管中于8 000 r/min、4 ℃離心15 min，用移液槍吸取上清液放入燒杯中混合均勻即為可溶性蛋白的提取液。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法[3]測定，吸取100 μL提取液放入比色管，以加100 μL、50 mmol/L、pH=7.8的Tris-HCl緩沖液為空白對照，然后加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，混勻靜置20 min后，用紫外分光光度計在595 nm處測量其吸光度值。

1.3.3 多肽的提取及含量測定

稱取0.2 g脫脂豆粉放入燒杯并加入5 mL、0.1 mol/L、pH=8.8的Tris-HCl緩沖液，低溫攪拌提取1 h，然后放入5 mL離心管中于5 000 r/min、4 ℃離心15 min,用移液槍吸取1 mL上清液放入燒杯中并加入1 mL 12%三氯乙酸，靜置30 min后放入5 mL離心管中于10 000 r/min、4 ℃離心15 min，用移液槍吸取上清液放入燒杯中混合均勻后即為多肽的提取液[4-5]。多肽含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定，吸取100 μL上清液放入比色管，以加100 μL、0.1 mol/L、pH=8.8的Tris-HCl緩沖液為空白對照，然后加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，混勻靜置20 min后，用紫外分光光度計在595 nm處測量其吸光度。

1.3.4 多酚的提取及含量測定

稱取0.1 g脫脂豆粉放入燒杯中，然后加入2.5 mL無水乙醇，在低溫避光密封的條件下提取2 h，然后放入5 mL離心管中于4 000 r/min、20 ℃離心15 min，用移液槍吸取上清液放入燒杯中混合均勻即為多酚的提取液[6]。多酚含量采用福林-肖卡法[7]測定，吸取200 μL提取液放入比色管中加1 800 μL蒸餾水，以加200 μL無水乙醇的比色管為空白對照，加入100 μL福林酚試劑混勻后靜置8 min在分別向比色管中加入300 μL Na2CO3溶液(l20 g/L)，放入30 ℃水浴鍋中避光水浴30 min，取出后用紫外分光光度計在760 nm處測量其吸光度。

1.3.5 羥基自由基清除能力的測定[8]

目前，臨床上尚無特效藥物用于治療面部激素依賴性皮炎。常規(guī)西藥或外用綜合治療該病可達(dá)到百分之八十以上，但治療結(jié)束后復(fù)發(fā)風(fēng)險較高，臨床治愈率也較低。激素依賴性皮炎是隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展而發(fā)生的皮膚病。糖皮質(zhì)激素具有抗炎，免疫抑制和抗過敏等作用，對皮膚病有一定治療作用，但若選擇不當(dāng)和藥物濫用，可引起激素依賴性皮炎的發(fā)生，出現(xiàn)臉部灼熱和瘙癢，甚至影響美觀，對患者社交、生活和工作均產(chǎn)生不良影響，需要給予有效治療[3]。

在1 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH=7.4)中加入 0.5 mL H2O 、0.5 mL 鄰二氮菲試劑(1.865 mmol/L)、0.5 mL FeSO4試劑(1.865 mmol/L)、0.5 mL樣品或0.5 mL H2O2(0.03%，體積分?jǐn)?shù))，混勻，放置5 min后用紫外分光光度計在510 nm處測定吸光度。按式(1)計算羥基自由基清除率。

(1)

式中：As為加入待測液的吸光度值；Ab為不加待測液與氧化劑的對照值；An為不加待測液的對照值。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測定[9]

稱取20 mg DPPH溶于250 mL無水乙醇中制得DPPH溶液。取0.5 mL樣品加無水乙醇將樣品稀釋至4 mL，取一組比色管A1分別向管中加2 mL樣品和2 mL DPPH溶液，另取一組比色管A2分別向管中加2 mL樣品和2 mL無水乙醇，再取一個比色管A0向管中加2 mL無水乙醇和2 mL DPPH溶液，以無水乙醇作參比，混勻后靜置30 min，放入分光光度計中于503 nm處測吸光度，清除率可式(2)計算：

(2)

式中：A1為DPPH溶液與樣品反應(yīng)后的吸光度；A2為樣品與無水乙醇本身的吸光度；A0為DPPH溶液未與樣品反應(yīng)的吸光度。

1.3.7 ABTS自由基清除率的測定[10]

取ABTS儲備液(7.4 mmol/L)和K2S2O8試劑(2.6 mmol/L)各1 mL混合，室溫避光條件下靜置12 h～16 h，然后用無水乙醇稀釋至其A734 nm=0.7±0.02，制得ABTS工作液。取ABTS工作液3 mL，分別加入150 μL的樣品或乙醇，振蕩10 s，靜置6 min，用紫外分光光度計在734 nm處測定吸光度。按式(3)計算ABTS自由基清除率。

(3)

1.3.8 總黃酮含量的測定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，用80%的甲醇配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，用紫外可見分光光度計在200 nm～360 nm處進(jìn)行光譜掃描，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長。然后取稀釋的樣品，在蘆丁的最大吸收波長處測吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線得到總黃酮含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃豆醋浸過程中可溶性蛋白含量的變化

用白醋和陳醋浸泡的黃豆中可溶性蛋白含量的變化如第3頁圖1和圖2所示。在白醋和陳醋中，隨著浸泡時間的延長，黃豆中可溶性蛋白含量明顯地降低。在浸泡1 d后白醋豆的可溶性蛋白的含量就降低到3.08 μg/mL，下降了76.4%；陳醋豆的可溶性蛋白含量降低到5.41 μg/mL，下降了58.7%。此后，隨著時間的延長，可溶性蛋白的含量出現(xiàn)了起伏變化，但是總體趨勢降低。可溶性蛋白濃度降低可能是由于大多數(shù)可溶性蛋白會降解成為小分子進(jìn)入到醋液中，可溶性蛋白含量的升高可能是由于其中的部分蛋白復(fù)合物經(jīng)過較長時間(白醋27 d，陳醋23 d～27 d)的浸泡之后發(fā)生了降解，釋放出一部分可溶性蛋白產(chǎn)物造成了可溶性蛋白含量升高，之后又被降解成小分子進(jìn)入醋液中而使可溶性蛋白含量下降。

圖1 白醋浸泡過程中黃豆可溶性蛋白含量的變化

圖2 陳醋浸泡過程中黃豆可溶性蛋白含量的變化

2.2 黃豆醋浸過程中多肽含量的變化

用白醋和陳醋浸泡的黃豆中多肽質(zhì)量濃度的變化如圖3和圖4所示。在白醋和陳醋中，隨著浸泡時間的延長，黃豆中多肽含量總體呈上升趨勢。在浸泡1 d后白醋豆的多肽質(zhì)量濃度就升高到1.77 μg/mL；陳醋豆的多肽質(zhì)量濃度升高到2.48 μg/mL。此后，隨著時間的延長，多肽的含量出現(xiàn)了較大的起伏變化。多肽濃度升高可能是由于大多數(shù)可溶性蛋白會降解成為多肽，多肽含量的下降可能是由于其中的多肽被降解成小分子進(jìn)入醋液中而使多肽含量下降。

圖3 白醋浸泡過程中黃豆多肽質(zhì)量濃度的變化

圖4 陳醋浸泡過程中黃豆多肽質(zhì)量濃度的變化

2.3 黃豆在醋浸過程中多酚含量的變化

用白醋和陳醋浸泡的黃豆中多酚含量的變化如圖5和圖6所示。在白醋和陳醋中，隨著浸泡時間的延長，黃豆中多酚含量總體呈先下降后上升趨勢。在浸泡1 d后白醋豆的多酚的質(zhì)量濃度就下降到32.48 μg/mL；陳醋豆的多酚質(zhì)量濃度下降到30.70 μg/mL，與對照相比多酚含量下降了近50%。此后，隨著時間的延長，白醋和陳醋浸泡的黃豆中多酚含量的變化出現(xiàn)了差別。白醋豆中多酚含量總體呈現(xiàn)一種平穩(wěn)的狀態(tài)，而陳醋豆中多酚含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，在第31天多酚質(zhì)量濃度達(dá)到最大，為68.64 μg/mL。

圖5 白醋浸泡過程中黃豆多酚質(zhì)量濃度的變化

圖6 陳醋浸泡過程中黃豆多酚質(zhì)量濃度的變化

多酚質(zhì)量濃度的降低可能是由于大多數(shù)可溶性蛋白會降解成為多酚，多酚含量的下降可能是由于其中的多酚溶于醋液中而使多酚含量降低。另一方面，較長時間的醋浸會有助于黃豆中不溶性酚類物質(zhì)的溶出，同時醋中的某些多酚類成分也會滲透到黃豆中，導(dǎo)致醋豆中多酚含量增加，并且由于白醋和陳醋釀造原料和方法不同，其中所含多酚類物質(zhì)的含量不同，這也導(dǎo)致了醋豆中多酚含量的變化差異，但這有待于進(jìn)一步的研究。

2.4 黃豆在醋浸過程中總黃酮含量的變化

用白醋和陳醋浸泡的黃豆中總黃酮含量的變化如圖7和圖8所示。在白醋和陳醋中，隨著浸泡時間的延長，黃豆中總黃酮含量變化趨勢有所不同。在浸泡1 d后白醋中黃豆的總黃酮的質(zhì)量濃度就下降到0.51 mg/mL；陳醋中黃豆的總黃酮質(zhì)量濃度下降到0.48 mg/mL，與對照相比總黃酮質(zhì)量濃度分別下降了31.4%和35.7%。此后，隨著時間的延長，白醋和陳醋浸泡的黃豆中總黃酮質(zhì)量濃度的變化出現(xiàn)了差別。白醋中黃豆的總黃酮質(zhì)量濃度總體呈現(xiàn)一種平穩(wěn)的狀態(tài)，在第11天達(dá)到最大值。而陳醋中黃豆的總黃酮質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯的上升趨勢但趨于平穩(wěn)，在第19天總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到最大。總黃酮質(zhì)量濃度的降低可能是由于部分黃酮類物質(zhì)被醋酸降解。另一方面，較長時間的醋浸會使醋中的某些總黃酮類成分滲透到黃豆中，導(dǎo)致醋豆中總黃酮質(zhì)量濃度增加，并且由于白醋和陳醋釀造原料和方法不同，其中所含總黃酮類物質(zhì)的含量不同，這也導(dǎo)致了醋豆中總黃酮含量的變化差異，這還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖7 白醋浸泡過程中黃豆總黃酮質(zhì)量濃度的變化

圖8 陳醋浸泡過程中黃豆總黃酮質(zhì)量濃度的變化

2.5 黃豆在醋浸過程中抗氧化性的變化

2.5.1 羥基自由基清除能力的測定結(jié)果

用白醋和陳醋浸泡的不同醋浸時間的樣品，取相同體積且多酚質(zhì)量濃度均為30 μg/mL時羥基自由基清除率的變化如圖9和圖10所示。在浸泡的第一天，無論是白醋還是陳醋浸泡的黃豆中所提取的多酚的羥基自由基清除率最大，分別為58.38%和63.11%。隨著浸泡時間的延長，多酚提取物的羥基自由基清除率逐漸下降。白醋豆中多酚的羥基自由基清除率為逐步下降趨勢；陳醋豆第5天至第23天的樣品中多酚的羥基自由基清除率維持了一個比較穩(wěn)定的水平。推測在浸泡早期，部分物質(zhì)被醋酸降解形成了具有較強(qiáng)的羥基自由基清除率的多酚物質(zhì)，而較長時間的醋浸會使多酚類物質(zhì)組成或結(jié)構(gòu)上發(fā)生進(jìn)一步的改變，導(dǎo)致樣品多酚提取物的羥基自由基清除率下降。

圖9 白醋浸泡過程中黃豆羥基自由基清除率的變化

圖10 陳醋浸泡過程中黃豆羥基自由基清除率的變化

2.5.2 DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果

用白醋和陳醋浸泡的不同醋浸時間的樣品，取相同體積且多酚質(zhì)量濃度均為30 μg/mL時DPPH自由基清除率的變化如第5頁圖11和圖12所示。隨著浸泡時間的延長，不同浸泡時間樣品的多酚提取物的DPPH自由基清除率逐漸增大。白醋豆中多酚的DPPH自由基清除率從第9天起達(dá)到一個相對穩(wěn)定的水平；陳醋豆樣品中多酚的DPPH自由基清除率逐漸上升。推測較長時間的醋浸會使多酚類物質(zhì)組成或結(jié)構(gòu)上的改變，產(chǎn)生了DPPH自由基清除率較強(qiáng)的成分。

圖11 白醋浸泡過程中黃豆DPPH自由基清除率的變化

圖12 陳醋浸泡過程中黃豆DPPH自由基清除率的變化

2.5.3 ABTS自由基清除能力的測定結(jié)果

用白醋和陳醋浸泡的不同醋浸時間的樣品取相同體積且多酚質(zhì)量濃度均為30 μg/mL時ABTS自由基清除率的變化如圖13和圖14所示。隨著浸泡時間的延長，不同浸泡時間樣品的多酚提取物的ABTS自由基清除率逐漸增大。白醋豆中多酚提取物的ABTS自由基清除率逐漸上升，第29天樣品的多酚提取物的ABTS自由基清除率最高，為10.49%。陳醋豆樣品中多酚的ABTS自由基清除率從第1天起維持一個相對穩(wěn)定的水平，第19天樣品的多酚提取物ABTS自由基清除率最高，為7.24%。從總體來看，白醋中黃豆的多酚提取物與陳醋中黃豆相比其ABTS自由基清除率更高一些，但是與相同濃度下的DPPH自由基清除率相比則整體偏低。

圖14 陳醋浸泡過程中黃豆ABTS自由基清除率的變化

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了黃豆在東湖陳醋和東湖白醋浸漬過程中可溶性蛋白質(zhì)、多肽、多酚含量及其抗氧化性的變化。黃豆在醋浸過程中，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著降低，多肽含量總體呈增長趨勢。陳醋中黃豆的多酚含量及總黃酮含量隨浸泡時間逐步增大，且高于白醋中黃豆提取物。抗氧化活性方面，隨著浸泡時間增加，樣品相同濃度的多酚提取物羥基自由基清除率下降，而DPPH、ABTS自由基的清除能力呈上升趨勢。陳醋中黃豆多酚提取物的DPPH自由基清除率高于白醋中黃豆多酚提取物，而其他兩個抗氧化性指標(biāo)則相差不大。總之，采用陳醋浸泡黃豆在多酚及總黃酮含量及DPPH自由基清除率方面都優(yōu)于白醋，因此在醋豆食品加工當(dāng)中建議采用陳醋。