荷花花色苷的分離、純化及鑒定

許 永，蔡為榮，聞志瑩，祝 晗

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

荷花(Nelumbo Nucifera)是藥食同源植物，其性溫和，味微苦，可以活血止血、祛濕消風寒、清熱涼血、美容、解暑等，且能治療皰瘡、濕疹、跌打損傷、出血等癥。荷花原產于中國，至今已有3000多年，資源豐富。目前，已有學者[1-3]研究了荷花中黃酮類、荷花堿、揮發性油等一些活性物質，但相關文獻較少，鮮有見到這些活性物質的開發和利用，關于荷花的產品也僅僅只有荷花酒、荷花茶[4]等，其營養價值并沒有得到充分利用。

花青素是一種重要的天然水溶性黃酮類色素，廣泛分布于各種植物中，使得不同植物的根、莖、葉、花、果實和種子等具有不同的紫色和藍色[5]。花色苷具有獨特的生物活性，包括抗氧化、抗腫瘤和抗炎活性[6]等，這種化合物在許多研究中都引起了人們的廣泛關注[7-8]。然而，盡管它們在自然界中具有多樣性和廣泛分布性，但在市場上能買到的花色苷數量有限，而且價格昂貴。據文獻[9]報道，荷花中含有多種花色苷，但是目前，還沒有文獻對荷花中花色苷的制備進行研究。

一般來說，花青素的制備生產需要3個主要步驟，即提取、純化和分離。大孔吸附樹脂作為一種低成本、易獲得的分離材料，已被廣泛應用于多種植物花色苷的純化。然而，只使用大孔樹脂純化，不能制備出高純度的花色苷，還需要繼續結合其他的分離純化方法。而高速逆流色譜(HSCCC)作為一種新興的分離技術，具有操作簡便、制備量大、無不可逆吸附等特點，被廣泛用于花色苷色素類的分離。

研究擬利用AB-8大孔樹脂、聚酰胺柱層析、高速逆流色譜等技術手段對荷花色苷進行分離和純化，旨在AB-8大孔樹脂和聚酰胺純化的基礎上，再利用高速逆流色譜技術進一步探討荷花花色苷分離純化工藝，以期對花色苷進行有效分離，提高其純度，并通過液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)對花色苷鑒定。這不僅能為擴大荷花花色苷應用范圍提供技術參考，同時也有助于今后進一步對荷花花色苷單體進行分離研究。

物流企業按照不同的作業劃分為：運輸中心、倉儲中心、包裝中心、配送中心及物流信息中心。現以包裝作業中心發生的人力費用為例，包裝作業中耗費的資源包括人力費用、折舊費、維修費、水電費、物料費等。對水費來說資源動因是水的噸位數，包裝中心的成本動因是人工工時。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

(3)花色苷的質量濃度和純度的測定。采用pH示差法，參考Denev P[10]等的方法略作改動。稱取質量m(mg)花色苷粉末用蒸餾水溶解，定容到體積V(mL)，然后取1 mL用pH為1.0的氯化鉀緩沖液稀釋至10 mL，另取1 mL用pH為4.5的乙酸鈉緩沖液稀釋至10 mL，分別在520 nm下和700 nm下測吸光值。花色苷質量濃度c(g/L)和純度α按式(1)、式(2)計算。

1.2 試驗設備

HH-6恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；RE-85Z旋轉蒸發儀(上海青浦滬西儀器廠)；SHB循環真空泵(鄭州市上街華科儀器廠)；UVmini-1280紫外可見分光光度計(日本島津公司)；DHL電腦數顯恒流泵、冷凍干燥機(美國SIM公司)；高速逆流色譜儀(上海同田生物技術有限公司)；Agilent 1100高效液相色譜、Agilent 1290高效液相色譜-G6545四級桿飛行時間質譜聯用儀(美國Agilent公司)。

1.3 方法

所渭摘錄詞句的習慣就是說在讀書過程中，隨時記錄自己喜歡的名言警句以及優美詞句、精彩片段;所謂圈圈點點的習慣是指小學生在讀書的過程中，積極思考，用筆在書上圈畫批注，圈記讀書過程中的生字生詞，記下自己讀某段時的觀點和想法;所謂寫讀后感的習慣是指讀一篇文章或一本書以后，把自己心中的感悟寫出來。這一點很重要，讀后感寫多了寫作素材的積累也就越來越多，自己寫文章時就可以信手拈來。只要學生在讀書后心有感悟，寫成片段或者整篇都行，學生在寫讀書體會時必然經過思考，細心揣摩自己的感悟與作者要表達的感情，這樣邊想邊寫，不但增長了知識，而且積累了深厚的語言功底，從而能夠提高寫作能力。

式中，A=(ApH 1-ApH 4.5)520 nm-(ApH 1-ApH 4.5)700 nm；484.82是矢車菊-3-葡萄糖苷氯化物的相對分子量；24 825是矢車菊-3-葡萄糖苷氯化物在pH為1.0的緩沖液中520 nm下的摩爾吸光系數；V是花色苷溶液體積；DF為稀釋倍數。

材料：干荷花(山東濟寧)。試劑：聚酰胺(100～200目)；AB-8大孔樹脂；無水乙醇(AR)；鹽酸(AR)；氯化鉀(AR)；冰醋酸(AR)；醋酸鈉(AR)；甲醇(AR)；乙酸乙酯(AR)；甲基叔丁基醚(AR)；正丁醇(AR)；乙腈(HPLC)；TFA(HPLC)；甲酸(HPLC)。所有試劑皆購買于國藥集團化學試劑有限公司。

(1)

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(2)荷花花色苷的提取。將荷花花瓣于35 ℃烘干，然后粉碎，過80目篩。稱取荷花粉末，按照料液比1∶25加入pH為2的60%乙醇溶液(鹽酸調節)，常溫下避光攪拌浸提60 min。然后抽濾，濾渣再次浸提，合并兩次濾液，真空濃縮。將濃縮液加入4倍體積的無水乙醇，靜置12 h，進行醇沉，除去濃縮液中的多糖成分。

2.2.2 FPG 繪制ROC曲線，FPG對2型糖尿病進行診斷的最佳切點為6.44 mmol/L，特異度為86.3%，靈敏度為89.0%；在43例FPG＜6.44 mmol/L患者中，IGT7例，NGT18例，IFG5例，IFG+IGT5例，DM7例；而在 FPG≥4.44 mmol/L61例患者中，IFG、IGT與NGT均為0例，IFG+IGT6例，DM56例。

(4)乙酸乙酯萃取。醇沉結束，濾去沉淀的多糖，濾液低溫濃縮除掉乙醇，將濃縮液倒入萃取瓶中，加3倍體積的乙酸乙酯，震蕩充分，避光靜置4 h，萃取完畢后保留水相，以除去濃縮液中的脂溶性成分。對乙酸乙酯相全波長掃描，考察萃取次數對萃取效果的影響。

(5)AB-8大孔樹脂純化花色苷。參照李穎暢[11]等，選擇AB-8大孔樹脂純化荷花花色苷(規格2.6 cm×60 cm)。將預處理過的大孔樹脂濕法裝住，上樣時考察了花色苷樣品溶液pH(1、2、3、4、5)、質量濃度(0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL)、上樣流速(0.5 mL/min、1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min)對大孔樹脂吸附的影響，并測定了泄漏曲線；洗脫時考察了洗脫液pH(1、2、3、4、5)、流速(0.5 mL/min、1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min)、乙醇體積分數(10%、20%、30%、60%)對洗脫效果的影響。通過測定洗脫液的吸光度來計算花色苷的吸附解析率，繪制吸附解吸曲線，確定最佳工藝參數，獲得純化后的花色苷樣品1，測定純度。吸附率E和解析率D按式(3)、式(4)計算。

隨著新課程改革的不斷推進，初中體育教學的現狀相較于以往有了很大的改善，教學水平有了顯著提高，學生的身體素質和心理素質有了顯著增強。但是從目前初中體育教學的開展現狀來看，在教學實踐中仍舊存在一定的問題，而學生主動參與性較低便是其中之一。學生作為體育教學的主體，一旦主動參與性不足，則會直接對教學質量造成影響，也就導致無法實現既定的教學目標。因此，必須要采取有效手段加以解決。

(3)

(4)

式中，c0為花色苷樣液質量濃度；c1為上樣完畢流出液質量濃度；c2為花色苷洗脫液質量濃度；V0為花色苷樣液體積；V2為花色苷洗脫液體積。

(6)HSCCC分離荷花花色苷。將大孔樹脂柱純化后的樣品1用聚酰胺柱進行純化，50%甲醇-水(0.1%乙酸)反相洗脫，除去鞣質和低極性雜質，濃縮凍干得純化后樣品2，測定純度。參考劉雪輝[12]方法以水∶甲基叔丁基醚∶正丁醇∶乙腈(6∶1∶3∶1)含0.1%TFA配置溶劑體系，于分液漏斗中靜置1 h分層，固定相為上相，流動相為下相，超聲脫氣25 min。將上相以30 mL/min泵入管路，直至泵滿。再以2 mL/min的流速泵入下相，溫度25 ℃，轉速850 r/min，檢測波長280 nm。待整個體系平衡時，稱取100 mg花色苷樣品2于10 mL流動相溶解，進行上樣。根據色譜圖的出峰情況，收集每個組分，以獲得高純度的花色苷。

更重要的是，有時我們的耳朵告訴我們“這是極弱音”，但這只是我們的錯覺。實際上，在多數作品中，“極弱”的往往并非旋律聲部，而是旋律以下的伴奏聲部。如果演奏者無法把伴奏聲部（通常有較多音符）控制在極弱的層面，那就必須在旋律聲部上多加力量，那么整首作品就顯得過于粗暴。另外，旋律與伴奏聲部都彈成“極弱”也是常見謬誤。而控制伴奏聲部的極弱則要求我們將重心保持在肘關節，并將肘關節相應抬高，此時，我們即可自如地通過緊貼琴鍵的指尖第一關節，以極其微小的動作控制聲音。

液相條件:采用C18柱(4.6 mm×150 mm)，粒徑為3.5 μm，流速為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃。溶劑集體采用二元流動相。流動相A：含有0.5%甲酸的水溶液，流動相B:含有0.1%甲酸的乙腈溶液。采用現行洗脫模式，0～5 min，10%B；5～10 min，10%～20%B；10～14 min，20%～30%B；14～16 min，30%～60%B；18 min，60%～10%B；18～20 min，10%B。檢測波長為520 nm。

質譜條件:使用的質量檢測器是安捷倫飛行時間(TOF)質量分析儀，配備安捷倫噴射流電噴霧電離源。在以下條件下，干燥氣體溫度300 ℃，流量6.0 L/min；噴霧器壓力35 psi；護套氣體溫度350 ℃，流量11.0 L/min；毛細管電壓3 500 V；噴嘴電壓1 000 V；碎片器電壓175 V；撇渣器電壓65 V；掃描范圍從m/z100到m/z1 500。

2 結果與分析

2.1 乙酸乙酯萃取結果分析

花色苷萃取乙酸乙酯相紫外掃描圖如圖1所示。由圖1可以看出，乙酸乙酯相紫外光區280 nm和340 nm附近有吸收峰，而在可見光區520 nm附近沒有吸收峰，說明乙酸乙酯對除去黃酮類化合物有較好的效果，并且不會造成花色苷的損失。隨著萃取次數的增加，吸收峰越來越小，第1次萃取乙酸乙酯相最大吸收峰為1.906 A，第3次只有0.113 A，表明乙酸乙酯所能萃取出來的黃酮越來越少，第3次雖還含有少量黃酮，但吸收峰值接近于0，再增加萃取次數效果不明顯，選擇萃取3次。

圖1 花色苷萃取乙酸乙酯相紫外掃描圖

2.2 AB-8大孔樹脂動態吸附試驗

根據商務部公布的數據，中國煤炭使用補償費為5元/噸，二氧化硫完全治理費為485元/噸，以這些數據為基礎進行計算，計算公式如下：

由圖2b可知，大孔樹脂對花色苷的吸附率會隨著樣液質量濃度的增加而減小，在上樣質量濃度為0.5 g/L時，吸附率最高，為89.9%；上樣質量濃度為5 g/L時，吸附率最低，為67.2%。這可能是因為樹脂吸附過程是一個動態平衡的過程，平衡需要一定的時間。如果流速固定，大孔樹脂與樣品接觸的時間就固定，增大了上樣質量濃度，所需要的平衡時間就會增加。固定了接觸時間，樣品質量濃度增大，使得樹脂沒有吸附平衡，導致吸附率下降。圖2B中樣液質量濃度為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL時，吸附率分別為89.9%、88.6%、87.3%，差別不大，但是2 mg/mL上樣質量濃度會縮短大量的上樣時間，所以選擇樣液質量濃度為2 mg/mL。

由圖2c可知，大孔樹脂對花色苷的吸附率隨著上樣流速的增加而呈下降的趨勢，流速在0.5 mL/min時吸附率最高，為90.7%，在3 mL/min時吸附率最低，為77.9%。可能是由于固定上樣質量濃度，增大了上樣流速，縮短了接觸時間，導致吸附率下降。流速為1 mL/min時吸附率為88.9%，與0.5 mL/min時的吸附率差別較小，為節約上樣時間，選擇1 mL/min。

AB-8大孔樹脂純化花色苷動態吸附試驗結果如圖2所示。從圖2a中可以看出，AB-8大孔樹脂對花色苷的吸附能力隨著樣液pH的增加，先增大后減小，在pH為2時吸附率最高，pH為5時吸附率最低。這可能因為當pH為1時，花色苷主要存在形式為黃烊正離子結構，離子化合物不易被大孔樹脂吸附，當pH>2且繼續增大時，花色苷上的羥基電離氫質子容易與堿結合，導致花色苷與樹脂間的吸附能力減弱，使得吸附率下降[11]。所以上樣pH選擇2。

圖2 AB-8大孔樹脂純化花色苷動態吸附試驗

AB-8大孔樹脂純化花色苷泄漏曲線的測定如圖3所示。由圖3可以看出，在收集管數為33管時，為上樣泄漏點，即上樣終點。隨著上樣體積的增加，大孔樹脂吸附的花色苷越來越多，逐漸達到飽和，再繼續增加上樣體積，由于樹脂的飽和，花色苷不再被吸附，而隨著樣液流出來。當流出液吸光度為樣液吸光度的10%時為泄漏點的判定點即上樣終點。按分部收集器每管收集10 mL，即上樣體積為330 mL。

定義7 稱ftr/tr-1(A(tr)/A(tr-1))，(2≤r≤m)為馬爾可夫過程{ξ(t)，t∈T}，(t1 <…

(7)LC-MS檢測鑒定。

圖3 AB-8大孔樹脂純化花色苷泄漏曲線的測定

2.3 大孔樹脂動態解析試驗

洗脫液流速和pH對花色苷洗脫效果的影響如圖4所示。由圖4a可知，隨著乙醇洗脫液流速的增大，花色苷流出液的峰高越來越低，并且峰型變寬，而且洗脫花色苷所需要的洗脫液也相對增加。流速為0.5 mL/min時峰最高，吸光度為1.12 A，完全洗脫所需體積為360 mL；流速為3 mL/min時峰最低，吸光度為0.621 A，完全洗脫所需體積為700 mL，洗脫液的用量約為流速是0.5 mL/min時的一倍。這不僅會造成乙醇浪費，而且還加重了后續花色苷洗脫液的濃縮任務。圖4a中，流速為1 mL/min時，峰吸光度為1.04 A，完全洗脫所需洗脫液體積為400 mL，與0.5 mL/min差別較小，從時間考慮，1 mL/min節約了近一半的時間，所以選擇洗脫液流速為1 mL/min。

由圖4b可知，花色苷解析率隨著pH的增大而減小，在pH為1時，解析率最高為88.9%，pH為5時，解析率最小，為66.2%。圖4b中pH為2時的解析率為87.7%，與pH為1時的解析率差別較小。但在pH為1時，酸性較大，花色苷在此條件下，可能會使相連的糖基易水解，造成花色苷結構的不穩定[13]，所以選擇洗脫液pH為2。

圖4 洗脫液流速和pH對花色苷洗脫效果的影響

為了去除花色苷提取物中的雜質，并保證花色苷被洗脫下來，選擇了10%、20%、30%、60% 4個梯度的乙醇進行洗脫。不同體積分數洗脫液紫外掃描圖如圖5所示。從圖5可以看出，10%和20%的乙醇洗脫液在280 nm和520 nm下有吸收峰值，分別為A280nm=0.771、A520nm=0.437和A280nm=0.863、A520nm=0.452；并且在520 nm下的吸收峰高于30%和60%的乙醇洗脫液。而30%和60%的洗脫液在520 nm處有吸收峰，而在280 nm下卻無吸收峰，說明在這兩個洗脫液中花色苷含量非常低，甚至可能沒有花色苷。這是因為花色苷類物質不僅在可見光區520 nm附近有吸收峰，而且在紫外280 nm附近也有較大的吸收峰，所以通過測定色素的紫外-可見光譜，就可以判斷是否含有花色苷類物質[14]。不同體積分數洗脫液對荷花花色苷洗脫效果的影響如表1所示。由表1可知，10%和20%洗脫液中花色苷純度分別為23.5%和24.1%，遠遠高于30%和60%洗脫液的2.11%和0.82%，30%和60%洗脫部分雜質較多。且在洗脫液乙醇體積分數為20%時，解析率可以達到85.2%，與30%和60%的解析率相差較小，所以選擇20%乙醇體積分數洗脫。既節約了乙醇，又方便后續對花色苷的分離實驗。

將花色苷提取物通過AB-8大孔樹脂在最佳工藝下純化，荷花花色苷純度由4.32%提升到了23.7%，純度提高了近5.5倍，說明AB-8大孔樹脂對花色苷的純化效果較好。

表1 不同體積分數洗脫液對荷花花色苷洗脫效果的影響

2.4 HSCCC分離荷花花色苷

HSCCC分離荷花花色苷如圖6所示。采用1.3(6)的方法，以水∶正丁醇∶甲基叔丁基醚∶乙腈(6∶3∶1∶1，V/V)含0.1%甲酸作為溶劑體系，通過HSCCC分離，得到4個組分。對收集的4個組分單獨進行紫外鑒定，發現組分2和組分4在520 nm附近無特征吸收峰，而組分1和組分3在280 nm和520 nm處都有吸收峰，故推測組分2和組分4為非花色苷類物質，組分1和組分3為花色苷類物質。在該條件下，上樣量100 mg干粉，一次性制得組分1干粉16.44 mg，純度為76.1%，組分3干粉29.16 mg，純度為83.3%，花色苷回收率為91.1%。

峰會上，中國汽車維修行業協會常務副秘書長王逢鈴為峰會致辭。上海鉅軒汽車用品有限公司董事長王海霞以“逆向盈利新商業模式”為主題進行培訓式演講。演講內容涵蓋了“什么是汽車服務終端商業模式”、“盈利模式如何打造”、“賦能終端該如何去做”以及“什么是逆向盈利”等。峰會現場氣氛活躍，與會嘉賓們熱情高漲、收獲頗豐。

圖5 不同體積分數洗脫液紫外掃描圖 圖6 HSCCC分離荷花花色苷

2.5 LC-MS檢測

HSCCC分離荷花花色苷組分液相檢測圖如圖7所示。由圖7可以看出,組分1中含有1種花色苷為色素Ⅲ，出峰時間為10.10 min；組分3中含有兩種花色苷為色素Ⅰ和色素Ⅱ，出峰時間分別為4.96 min和6.77 min。荷花花色苷鑒定結果如表2所示。由表2可知，色素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在520 nm下都有最大吸收峰。且A440nm/Amax百分比分別為29%、31%和27%，接近30%；A310nm/Amax百分比分別為7.5%、9.4%和11%，都小于20%；表明了3種色素糖苷的位置，都為花色素-3-O-糖苷，并且都未發生酰基化[13]。花色苷質譜分析圖如圖8所示。由圖7a和圖8a可知，色素Ⅰ保留時間為4.96 min，MS信息表明，其分子離子峰[M+]為597.1，在質譜中檢測到碎片離子為m/z 303.1；m/z 303.1是飛燕草色素的特征離子，碎片([M-294]+)對應于花色苷分子中失去一個桑布糖基所得的碎片。該研究結果與Du[15]研究飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷的質譜信息相一致。因此，推測色素Ⅰ為飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷。由圖7a和圖8b可知，色素Ⅱ保留時間為6.77 min，MS信息表明，其分子離子峰[M+]為581.1，碎片離子為m/z 287.1。m/z 287.1是矢車菊色素的特征離子，碎片([M-294]+)對應于脫去一分子桑布糖基后所得的碎片，該研究結果與Du[15]和Zhao[16]的研究中矢車菊-3-桑布雙糖苷的質譜信息相一致，因此推測色素Ⅱ為矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷。從圖7b和圖8c可以看出，色素Ⅲ的保留時間為10.10 min，MS信息表明，其分子離子峰[M+]為493.1，在質譜中檢測到的碎片離子為m/z 331.1。m/z 331.1為錦葵色素的特征離子，碎片([M-162]+)對應脫去一分子葡萄糖所得到的碎片，該研究結果與Deng[9]的研究中錦葵色素-3-O-葡萄糖苷的質譜信息一致，故推測色素Ⅲ為錦葵色素-3-O-葡萄糖苷。

圖7 HSCCC分離荷花花色苷組分液相檢測圖

圖8 花色苷質譜分析圖

表2 荷花花色苷鑒定結果

3 結論

實驗發現用乙酸乙酯萃取，能較好地去除荷花花色苷浸提液中的非花色苷黃酮類物質；在優化后的最佳AB-8大孔樹脂純化條件下純化荷花花色苷，可以使花色苷的純度達到23.7%，純化效果較好；通過HSCCC技術分離花色苷，能夠獲得兩種較高純度的花色苷組分1和組分3，純度分別為76.1%和83.3%，經LC-MS對兩種花色苷組分鑒定，發現花色苷組分1含有一種花色苷，推測為錦葵色素-3-O-葡萄糖苷，組分3含有兩種花色苷，推測為飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷和矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷。該方法操作簡便，重現性好，適于大量制備荷花高純度花色苷，為花色苷進一步藥理研究及質量控制提供物質基礎。