汽爆預處理提取西番蓮果膠及其性質分析

梁泳倫，鄭麗麗，楊旸，鄭曉燕，校導，鐘爽，艾斌凌，楊勁松，盛占武，*

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南海口570228；2.中國熱帶農業科學院?？趯嶒炚?，海南?？?70102；3.?？谑邢憬渡飳W重點實驗室，海南?？?70102）

西番蓮（Passiflora edulis Sims）原產于巴西，在全球范圍內廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區[1]，國內主要集中在海南、廣西、云南、貴州、福建和臺灣等地[2]，近年來種植面積不斷增加，產業發展勢頭迅猛。根據農業農村部農墾局數據：截至2018年，全國實有種植面積66.7萬畝，產量59萬噸，產值高達30億元，其中以廣西和福建為主要種植區域，產量產值占全國80%以上。2019年預計全國西番蓮產量達到100萬噸以上。西番蓮果肉風味獨特，果汁、果脯等加工產品的需求也不斷增加[3]。在加工過程中，西番蓮果皮占鮮果重量的50%以上，目前大多直接廢棄，不僅造成資源浪費，而且也存在污染環境的風險[4]。西番蓮果皮基本組成中水分為9.93%、灰分7.52%、蛋白4.05%、可溶性膳食纖維19.20%、不可溶性膳食纖維38.05%、碳水化合物占21.28%、脂肪不高于0.1%[5]。研究表明，西番蓮果皮具有降血壓，改善骨關節炎的癥狀和減輕哮喘等功能[6]，果皮中以果膠含量最為豐富，占西番蓮果皮干重的15%～20%。因此，西番蓮果膠的提取利用是解決果皮廢棄物綜合利用的有效途徑。

果膠在食品中的應用主要作為膠凝劑，增稠劑和膠體穩定劑[7]。由于果膠的功能性質和應用，全球對它的需求以每年約4%～5%的速度增長。目前，商業果膠大多來源于柑桔皮和蘋果渣，隨著全球市場對果膠的需求不斷增長，新型植物原料也備受關注，例如柚子皮[8]，可可豆殼[9]，南瓜[10]，石榴皮[11]和油菜籽[12]等，西番蓮作為果膠來源也備受關注。酸提取法是一種傳統的提取方法，提取工藝較成熟，但是酸提取法提取溫度高，提取時間長，導致產品質量下降和耗能高，因此，開發新的提取方法是很有必要的。近年來報道了微波輔助提取、亞臨界提取法和酶提取法等提取果膠，這些方法一定程度上提高了提取率和果膠質量，但是也存在一定的缺陷如設備成本高，工藝環境要求高等。此外，已報道的西番蓮果皮果膠提取方法還有電場加熱提取法[13]、磁性納米生物催化劑技術[11]和聯合工藝法提取果膠。近年來，蒸汽爆破預處理法引起來廣泛的關注。前期已利用蒸汽爆破結合水代法成功建立了油茶籽油高效提取和蛋白改性的方法[14-15]。蒸汽爆破過程是在高溫高壓瞬時泄壓致使物料的細胞壁破裂、半纖維素和木質素降解、胞內物質隨著細胞的破裂而溶出，進而提高提取和預處理效率[16]，同時蒸汽爆破處理還具有環境污染少、效率高等優勢[17]。因此，本研究將以西番蓮果皮為研究對象，采用汽爆預處理結合傳統果膠提取工藝，比較汽爆處理對果膠的理化特性，建立西番蓮果皮果膠的高效提取方法，以期為西番蓮果皮的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西番蓮（紫果）：市售；半乳糖醛酸、咔唑、無水乙醇、95%乙醇、酚酞、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氫氧化鈉、Folin-Ciocalteu試劑：美國阿拉丁工業公司；濃硫酸、濃硝酸：國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

蒸汽爆破試驗臺（QBS-80）：河南省鶴壁正道生物能源有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DJ-S12）：上海精宏實驗設備有限公司；高速多功能粉碎機（DMF-10A）：永康市鉑歐五金制品有限公司；離心機（Heraeus Multifuge X3R）：德國Thermo Scientific公司；數顯旋轉蒸發儀（RV10）：德國IKA公司；節能型智能恒溫槽（DC-2015）：寧波新芝生物科技股份有限公司；精密電子天平（AL-104）、pH計（S20K）：上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司；數顯水浴恒溫振蕩器（SHC-CA）：常州普天儀器制造公司；紫外可見分光光度計（Evolution 300）：美國Thermo Fisher公司；傅立葉變換紅外光譜儀（TENSOR27）：德國BRUKER公司；高效液相色譜儀（e2695）：美國沃特世公司；掃描電子顯微鏡（HITACHI S-3000N）：日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 果皮的處理

參照Canteri等[18]的方法對果皮進行處理，具體方法如下：把西番蓮果切開并把果肉掏出，把剩下的果皮切成小塊，然后將果皮放置于沸水中加熱3 min，取出流水冷卻，瀝干水分并在電熱鼓風干燥箱于45℃干燥至恒重。用于酸提的果皮用高速多功能粉碎機進行粉碎并且過40目篩，得到西番蓮果皮粉，而用于汽爆預處理的果皮暫不進行粉碎處理，用密封袋分別收集果皮粉和干燥果皮。

1.3.2 果膠的酸提取

果膠的酸提取工藝參照de Oliveira等[19]方法略作修改。稱取10 g西番蓮果皮粉加入到500 mL錐形瓶中，再加入pH 2的HNO3溶液300 mL，在95℃的恒溫水浴鍋中提取60 min。處理后的樣品真空抽濾，收集濾液，旋轉蒸發（45℃），濃縮為原溶液體積的四分之一。然后加入3倍體積的95%乙醇溶液進行果膠沉淀，靜置 24 h，離心（4 000 g，10 min），得到果膠沉淀，在 45 ℃下干燥至恒重得到西番蓮果皮果膠。果膠提取率的計算公式如下：

式中：G1為果膠質量，g；G2為果皮粉質量，g。

1.3.3 果膠的汽爆提取

蒸汽爆破的預處理方法參照孫俊良等方法[20]略作修改，方法如下：將70 g經過1.3.1預處理的果皮裝入蒸汽爆破反應裝置中，然后關閉反應門，將材料放置在一個封閉的空間內。通入水蒸氣，在設定的壓力下（0、0.3、0.6、0.9、1.2 MPa） 維 持 60、90、120、150、180、210 s，然后瞬間釋放壓力。經過蒸汽爆破處理后的果皮放在45℃的烘箱中干燥至恒重，然后用高速多功能粉碎機進行粉碎并且過40目篩得到蒸汽爆破預處理的果皮粉。然后按照1.3.2方法進行提取。

1.3.4 酯化度（esterification degree，DE）測定

酯化度測定參照Bagherian等[21]，稱取0.2 g果膠樣品于250 mL錐形瓶，加入2 mL無水乙醇濕潤，再加入20 mL超純水，攪拌使果膠樣品完全溶解，加入5滴酚酞指示液，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至出現粉紅色并30 s內不褪色為滴定終點，記錄消耗的NaOH溶液的體積，記為V1。繼續加入10 mL濃度為0.1 mol/L NaOH溶液，放入恒溫振蕩器，30℃下以180 r/min搖晃2 h，加入10 mL 0.1 mol/L HCl溶液。加入5滴酚酞指示液，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至出現粉紅且30 s內不褪色，記錄消耗的NaOH溶液的體積，記為V2。果膠酯化度計算公式如下：

1.3.5 西番蓮果皮提取殘渣的掃描電鏡觀察

參照Rodsamran等[22]的方法，將提取殘渣分散固定在圓形金屬臺上，并使用精細涂層離子濺射涂覆一層薄金，然后置于掃描電子顯微鏡在10 kV加速電壓下，放大500倍和3 000倍（×3 k）觀察不同提取殘渣的組織形態。

1.3.6 果膠的紅外光譜分析

果膠的紅外光譜掃描參照Al-Amoudi等[23]，果膠的紅外光譜用溴化鉀壓片法測定。將樣品干燥至恒重，取少量果膠與溴化鉀以1∶50質量比混合均勻后壓片，用傅里葉紅外光譜儀中400 cm-1～4 000 cm-1的紅外區域進行掃描16次，掃描分辨率為4 cm-1。

1.3.7 果膠分子量的測定

參照Yuree等[8]方法略作修改。用超純水充分溶解果膠制的0.3%果膠溶液過0.22 μm微濾膜。使用裝有兩條串聯的水溶性GPC色譜柱（7.8×300 mm），連接到Waters 2414 RI檢測器的高效液相色譜儀測定果膠樣品的分子量。溫度參數為40℃下，流動相（0.05%NaN3溶液）的流速為0.6 mL/min。根據分子量為960、1 460、7 130、1 200、43 500、19 600、401 000 Da 和 800 000 Da葡聚糖校準曲線測定果膠分子量。

1.3.8 多酚含量的測定

1.3.8.1 沒食子酸標準曲線的制作

參照Maran等[24]方法分別吸取取濃度為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的 0.5 mL 沒食子酸標準液并加入2.5 mL Folin-Ciocalteu試劑（10%）和2 mL碳酸鈉溶液（7.5%），避光放置1 h后，在750 nm下測量混合物吸光度，制得標準曲線。

1.3.8.2 果膠多酚含量的測定

將0.5 mL的果膠溶液（1%）、2 mL的碳酸鈉溶液（7.5%）和2.5 mL的Folin-Ciocalteu試劑（10%）加入到具塞試管中。避光放置1 h后，在750 nm處測量吸收。根據標準曲線計算果膠中多酚含量，單位為沒食子酸當量（mg GAE/g果膠）。

1.3.9 果膠的DPPH自由基清除率測定

參照Dos Reis等[25]，將1 mL果膠溶液（濃度范圍從0.1 mg/mL～4.0 mg/mL）添加到4 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L）中。然后將其避光放置30 min，在517 nm處測定吸光度（樣品+無水乙醇作空白對照）。用相同濃度的抗壞血酸為對照。DPPH自由基清除率的計算公式如下：

式中：A為添加果膠或者抗壞血酸后混合物的吸光度；A0為果膠濃度為0時的吸光度。

1.3.10 果膠的流變特性

果膠的流變特性參照Rodsamran等[22]方法，使用具有20 mm平行板的流變儀研究果膠流變學特性。將果膠溶于40℃的蒸餾水中，攪拌直至完全溶解制成濃度為1%、2%和3%的溶液將用于流變分析。然后在25℃下以0.1 s-1～100 s-1的剪切速率評估流動性能。對于振蕩試驗，在10 rad/s的恒定頻率下，將剪切速率從0.01%逐漸增加到10%以執行振蕩應變掃描，確定線性黏彈性區域。對于振蕩頻率試驗，在25℃下以應變值為1%的條件下，角頻率范圍1 rad/s～100 rad/s下測定儲能模量G'和G''的變化。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3次，結果以平均值±標準差的形式。方差分析使用SPSS 23.0軟件分析。

2 結果與分析

2.1 蒸汽爆破對果膠提取率的影響

采用蒸汽爆破預處理以提高果膠提取率，探索不同汽爆強度（汽爆壓力和維壓時間）對果膠提取率的影響，結果如圖1所示。

圖1 汽爆壓力和維壓時間對果膠提取率的影響Fig.1 Effect of steam pressure and residence time on extraction yield of pectin

如圖1所示，在初始階段隨著汽爆強度的增加，西番蓮果皮果膠的提取率有顯著的提高，在汽爆壓力為0.6MPa、維壓120s時，獲得最大果膠提取率，為（18.84±0.32）%，而用傳統酸提法所得果膠提取率為（10.40±0.41）%，蒸汽爆破預處理果膠提取率上比酸提法提高了81.15%，并且在統計學上兩者存在顯著差異。此后，隨著汽爆強度的增加，果膠的提取率顯著降低，在1.2MPa、維壓120 s時，果膠提取率降低為（7.59±0.60）%，比未經汽爆處理的提取率變得更低。這一結果與Wang等[26]研究汽爆強度對可溶性膳食纖維含量變化趨勢相一致。因此，選擇合適的汽爆強度能獲得最高的果膠提取率，主要原因是蒸汽爆破處理使西番蓮果皮緊密的纖維結構解聚，酸提液更容易滲透進果皮內部，增加了果膠與酸溶劑接觸面積，最終使更多的果膠溶解在提取液中，進而提高果膠的提取率。然而，當汽爆強度過高時，果膠多糖降解為寡糖，在醇沉階段不能析出，導致了果膠提取率的顯著降低[27]。此外，與其他文章所報道的西番蓮果皮果膠的提取方法相比，如電場法（6.20%）[13]、超聲輔助提取法（12.67%）[19]、高壓處理法（14.34%）[28]和酒石酸提取法（18.2%）[29]，汽爆預處理結合酸提在果膠提取率上表現為更高效。

2.2 汽爆處理對果膠酯化度的影響

表1結果顯示了采用不同汽爆條件處理果皮對果膠DE值的影響。

表1 蒸汽爆破條件對果膠DE值的影響Table 1 Effect of steam explosion conditions on DE value of pectin

本次研究所得果膠DE值為66.26%～83.40%，均大于50%，屬于高甲氧基果膠。如表1所示，隨著汽爆壓力的增加和維壓時間的延長，果膠的DE值顯著降低，此外，酸提法所得果膠DE值為（83.40±0.49）%，顯著高于蒸汽爆破預處理酸提取所得果膠。研究表明，在高強度的汽爆處理下，果膠的DE值減少是由半乳糖醛酸鏈的去酯化引起的。值得注意的是，在0.6MPa的壓力下維壓120 s，雖然得到了最大的果膠提取率，但是，其DE值僅為（67.25±0.48）%，顯著低于條件為0.6 MPa，60 s所得到的果膠DE值（71.80±0.75）%，而且兩者之間提取率統計學上沒有顯著差異。果膠的DE值對果膠的凝膠條件和速度有很大的影響，對于高甲氧基果膠來說，DE值越高膠凝速度越快[30]。因此，綜合考慮果膠的提取率和DE值后，選取汽爆壓力為0.6 MPa、維壓時間60 s所得果膠進行后續性能測試。

2.3 汽爆處理對果皮表觀結構的影響

利用掃描電鏡觀察物料在汽爆預處理前后果皮結構的變化，結果如圖2所示。

圖2 果皮殘渣的掃描電子顯微鏡圖像Fig.2 Sanning electron microscopy images of peel residue

從圖2a，圖2b可以看出，酸提后果皮表面顯示出了一定程度的皺褶。汽爆法提取的果皮殘渣，除了有一定程度的皺褶外，表面還產生大量的小坑洞（圖2c，圖2d）?？梢?，汽爆預處理后果皮與提取液接觸面積更大，有效的促進了果膠的溶出，進而提高了果膠提取率。這些坑洞的產生是由于蒸汽爆破處理導致植物細胞炸裂，細胞壁破裂成孔隙以及非纖維素成分的降解所致[31]，因此，汽爆預處理可以改變果皮表觀結構，進而有利于大量果膠的溶出。

2.4 果膠的紅外光譜分析

汽爆前后果膠結構變化如圖3所示。

圖3 果膠的傅里葉紅外光譜圖Fig.3 The Fourier transform infrared spectra of pectin

兩種果膠均表現出典型的果膠傅里葉紅外光譜圖。在3 650 cm-1～3 200 cm-1處都有一個較大的吸收峰，由O-H的伸縮振動、半乳糖醛酸鏈間或鏈內的氫鍵引起[32]。2 926 cm-1處出現較弱的吸收峰，此外酸提法果膠在2853cm-1處出現弱峰，這都是-CH2中的C-H對稱伸縮振動和反對稱伸縮振動所致。1 746 cm-1附近的吸收峰為酯化的C=O振動產生，而未被酯化的C=O在1 620 cm-1振動產生吸收峰[26]。因此，通過計算1 746 cm-1處的峰面積除以1 746 cm-1和1 620 cm-1處的峰面積之和的比值可粗略估算果膠的DE值[33]。紅外光譜分析得到蒸汽爆破提取工藝果膠的DE值較酸提法果膠低。該結果與表2所示的DE值分析一致。1 300 cm-1～1 000 cm-1之間的吸收峰是由于C-O伸縮振動引起的，1 010 cm-1～1 150 cm-1之間的3個吸收峰表明西番蓮果皮果膠中含有吡喃糖[23]。

2.5 果膠的分子量和總酚含量

果膠的特性與其平均分子量密切相關，果膠的分子量、Mw/Mn和多酚含量測定結果見表2。

表2 果膠的分子量、Mw/Mn和多酚含量Table 2 Molecular weight，Mw/Mnand total phenol content of pectin

由表2可知，汽爆法提取的果膠平均分子量為0.95×105Da，遠低于酸提法的 6.98×105Da，此外，Mw/Mn為果膠多糖的多分散性指數，從結果可以看出兩種果膠具有相似且較低的多分散性，也再次證明兩種方法提取的果膠分子量較為集中?？梢?，汽爆處理過程中果膠發生了一定程度的降解，導致其分子量降低。此外，Adetunji等[34]研究表明，具有低分子量和化學修飾結構的果膠可以增加飽腹感和表現出選擇性的細胞毒性，具有抗結腸癌作用。此外，低分子量的果膠還具有降低膽固醇、降低胰島素和減少對胃多肽抑制的作用。

果膠中總酚的含量也是果膠性能的重要參數之一，多酚含量的高低直接影響果膠的抗氧化活性。多酚含量采用Folin-Ciocalteu方法測定，結果如表2所示，汽爆法提取的果膠總酚含量為18.82±0.10（mg GAE/g pectin），酸提法果膠為8.58±0.47（mg GAE/g pectin），多酚含量增加了1.19倍?？梢?，汽爆預處理不僅提高了果膠的提取率，還增加了果膠中多酚的含量，這一結果與Noda等[17]結果一致，主要是汽爆預處理過程中植物細胞壁破裂，細胞內容物大量釋放所致。

2.6 果膠的DPPH自由基清除活性

以果膠的DPPH自由基清除率代表其抗氧化活性。在該方法中，DPPH自由基清除活性取決于OD517的大小，當抗氧化劑去除DPPH自由基時，果膠溶液的顏色從紫色變為黃色表現為OD517變小。兩種果膠的DPPH自由基清除率如圖4所示。

圖4 果膠的DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH radical scavenging activity of pectin

在果膠濃度0.1 mg/mL～4.0 mg/mL的范圍內，DPPH自由基清除率隨果膠濃度的增加而顯著增加，汽爆法提取的果膠DPPH自由基清除率顯著高于酸提法，此外，當果膠濃度為12.0 mg/mL時，汽爆果膠的DPPH自由基清除率可達85.95%（數據未給出）但會產生少量沉淀，因此高濃度的DPPH自由基清除率沒有給出。這與果膠中多酚分析結果一致，進一步說明汽爆預處理增加了多酚含量[35]。因此，汽爆工藝可增加果膠的多酚含量和抗氧化活性。

2.7 果膠的流變特性

果膠在高黏度液體中的增稠作用可以通過多種方法測試，其中剪切流變學方法應用最為普遍[36]。在25℃下分別測試了3種濃度（1%、2%和3%）果膠的流動行為和黏彈性，結果如圖5所示。

圖5 果膠的流變特性Fig.5 Flow characteristics of pectin solution

1%濃度的汽爆果膠由于黏度較低，流動曲線無法連續測得；其余濃度都顯示了非牛頓流體的剪切稀化行為（圖5a，圖5b），其原因是剪切速度加快使果膠的分子間力減弱所致。在不同濃度溶液的測試中，高濃度果膠溶液的黏度比低濃度高。相同濃度的兩種果膠在剪切速度較高時，酸提法果膠黏度更大，這可能是酸提果膠的分子量高于汽爆果膠，果膠鏈相互作用或鏈的纏結作用更強，流動阻力更大所致。在低濃度果膠溶液中，隨著溶劑流過多糖鏈段，摩擦損失導致其黏度增加。當果膠溶液濃度增加時，果膠鏈聚集為三維網絡結構，使之需要更多的能量來破壞網絡結構[37]。根據Zhang等[38]研究結果顯示，大多數濃縮果膠溶液（質量濃度大于0.5%）通常會表現出這種行為。在高剪切速率下，所有溶液的行為均類似于牛頓流體，因為果膠分子被重新排列，方向與流動方向相同。

在25℃、1%的應變值下測定兩種果膠溶液的振蕩頻率如圖5c和圖5d所示，所有果膠溶液的G'和G''隨著角頻率的增加而增加。酸提果膠溶液最初為G'>G''，機械響應呈凝膠狀，隨著角頻率的增加，G''與G'相交最終G''>G'，而機械響應的表現類似于液體。汽爆果膠溶液濃度在1%和2%時與酸提果膠溶液的曲線相似，但當濃度增加到3%時，機械響應表現為凝膠狀行為（G'＜G''）。對于兩種工藝的果膠溶液，總體表現出隨著角頻率降低和濃度增加，機械響應更類似于凝膠。因此，汽爆果膠溶液黏彈性較酸提法好，其原因是汽爆果膠分子量和DE值更低所致。

3 結論

以西番蓮果皮為高甲氧基果膠的提取原料，用蒸汽爆破預處理果皮并用初步探究其工藝條件對果膠提取率的影響，然后把汽爆工藝所得果膠與傳統酸提醇沉法所得果膠進行結構和性質分析。通過試驗，得到結果：在蒸汽壓力為0.6 MPa，維壓時間為120 s，果膠提取率為18.84%，遠遠高于酸提法的果膠提取率。因此，在合適的汽爆強度包括汽爆壓力和維壓時間，蒸汽爆破工藝能夠大大提高果膠的提取率。此外，汽爆處理促進了果膠多糖的降解，從而降低了果膠的分子量。另外，結果表明，汽爆果膠的多酚含量和抗氧化性較高而且通過流變學分析得出汽爆工藝所得西番蓮果皮果膠都具有潛在的應用價值。