富含益生元的刺梨飲料配方的優化

朱一方，李貴榮，朱波，朱毅，*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100094；2.貴州省盤州刺梨產研中心，貴州六盤水553537）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的果實，又名茨梨、木梨子，在我國主要分布于貴州、四川、廣西、湖北、西藏等地[1]。研究表明，刺梨果富含多種功能性成分，如VC、超氧化物歧化酶、刺梨黃酮、刺梨多糖等[2]，是具有較高營養價值的藥食兩用植物[3]。刺梨果榨汁過濾得到刺梨原汁[4]芳香濃郁，但單寧等多酚物質含量較高，一般含量在0.6%～2.2%，因而澀味重，過高的單寧含量會對果汁產品穩定性、澄清度、風味、色澤等方面產生不利影響[5-7]，商品價值降低，因此，脫除單寧是提高刺梨果汁產品品質的有效措施。

益生元（prebiotics）是一種不能被人體消化酶消化的食物成分，能刺激某種益生菌的數量和活性從而改善人體的健康[8-9]。益生元根據其組成、結構以及在飲料中的應用研究，可將其分為低聚糖類和多糖類益生元，低聚果糖和低聚半乳糖是低聚糖類益生元的代表，而菊粉屬于多糖類益生元[10]。低聚果糖和菊粉結構均由葡萄糖和果糖構成，由于結構中單元之間是通過β-葡萄糖苷鍵相連，因此人體攝入后不能被小腸消化吸收，但在結腸內可被有益微生物分解利用而對人體健康有益[11-12]。低聚半乳糖是一種寡糖類混合物，具有熱量低、口感清爽的特點和促進腸道內有益菌的增殖，抑制腸道腐敗菌生長，改善消化系統功能，降低血清總膽固醇濃度，促進鈣的吸收及調節血糖等生理功能[13]。與蔗糖相比，低聚果糖的甜度約為蔗糖的40%～60%，低聚半乳糖約為25%左右，而菊粉則為20%～30%[14]。每人每天服用12 g菊粉有助維持正常腸道功能[15]。目前，益生元被廣泛地應用于早餐谷物、嬰幼兒食品以及保健食品等領域。國外，特別是日本，益生元飲品種類繁多[16]；近年來，我國也進行了多品種的益生元飲料研發，如邢穎等[17]采用銀杏葉、絞股藍復合飲料結合低聚果糖生產出的一款降“三高”飲品；葛兆強等[18]研究的功能性低聚糖在膠原蛋白飲料中的應用，但到目前為止，未見到益生元應用于刺梨飲料方面的報道。

添加益生元的刺梨飲料既能補充維生素C又有助于改善消化系統，且口感好，風味獨特，故本文為研究富含益生元的刺梨飲料的配方，采用單寧酶法去除刺梨果汁中的單寧，脫除澀味且保留刺梨原有的獨特芳香氣味，并探討單寧酶添加量、水解pH值、水解時間和水解溫度對單寧脫除效果的影響，采用菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖3種益生元代替普通甜味劑，以期為提高刺梨果汁加工產品質量提供技術來源，彌補富含益生元刺梨飲料的市場空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨原汁：貴州省宏財聚農刺梨王有限公司；單寧酶（250 U/g）：南寧東華恒道生物有限公司；明膠：河南博陽生物科技有限公司；單寧檢測試劑盒：齊一生物科技（上海）有限公司；小蘇打：市售；低聚果糖：河南盛牧生物科技有限公司；低聚半乳糖：北京康貝萊科技有限公司；菊粉：河南開濟貿易有限公司；所有配方用試劑均為食品級。

1.2 儀器與設備

可見分光光度計（721）：上海菁華科技儀器有限公司；pH計（雷磁PHS-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司；電子天平（LT5002T）：常熟市天量儀器有限責任公司；恒溫水浴鍋（XMTD203-HH）：江蘇中大儀器科技有限公司；臺式大容量冷凍離心機（L535R）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；高級臺式封閉電爐（DL-I-15）：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺梨果汁的制備

以純凈水與刺梨原汁體積比4∶1稀釋刺梨原汁，添加1%的明膠溶液，靜置12 h，以澄清果汁中的雜質。

1.3.2 脫澀單因素試驗

1.3.2.1 單寧酶添加量對刺梨果汁單寧含量的影響

刺梨果汁具有熱不穩定性[19]，根據梁芳等[20]對刺梨果汁的處理，取100 mL澄清后的刺梨果汁，分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的質量分數10%的單寧酶溶液，在pH 4.5、45℃條件下水解100 min，測定刺梨果汁中單寧含量。

1.3.2.2 水解pH值對單寧含量的影響

取100 mL刺梨汁，添加1 mL質量分數10%的單寧酶溶液，分別用小蘇打溶液調至pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，在45℃下水解100 min，測定刺梨果汁中單寧含量。

1.3.2.3 水解溫度對單寧含量的影響

取100 mL刺梨汁，添加1 mL質量分數10%的單寧酶溶液，分別 35、40、45、50、55 ℃，pH 4.5 的條件下水解100 min，測定刺梨果汁中的單寧含量。

1.3.2.4 水解時間對單寧含量的影響

取100 mL刺梨汁，添加1 mL質量分數10%的單寧酶溶液，在pH 4.5，40℃條件下，分別水解60、80、100、120、140 min，測定刺梨果汁中單寧含量。

1.3.3 單寧含量的測定

采用可見分光光度法，根據王勇等[21]的方法稍作修改，80℃水浴提取刺梨汁中的單寧，并使單寧在堿性環境下與磷鉬酸反應，生成藍色化合物，在760 nm處測定吸光值，根據以下公式計算單寧含量（μg/g鮮重）：

式中：V1為加入樣本體積，0.015 mL；V2為加入提取液體積，1 mL；W 為樣本鮮重，g；△A=A測定-A對照，測定組為樣品溶液，對照組為等量蒸餾水。

標準條件下測定的回歸方程為：

式中：x為標準品濃度，μg/mL；y為吸光值。

1.3.4 脫澀正交試驗

根據單因素試驗結果，選取單寧酶添加量（A）、酶作用 pH 值（B）、脫除溫度（C）、脫除時間（D）4個對單寧含量影響顯著的因素作為固定因子，變量的水平以1、2、3表示，以單寧含量為因變量，設計四因素三水平的正交試驗。脫澀條件優化的正交試驗設計如表1為所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 益生元添加量的優化試驗

分別配制質量濃度為25%的菊粉水溶液、低聚果糖水溶液和低聚半乳糖水溶液，取經脫澀試驗的最優條件脫澀后的刺梨果汁15 mL，按表2設計的添加量加入各添加劑，充分攪拌后進行感官評價測試[22]。

表2 三種益生元在刺梨果汁中的添加量Table 2 Amounts of three prebiotics added individually to cili juice

1.4 分析方法

單寧含量的測定：可見分光光度法；益生元添加量評定方法：感官評價法。邀請10位評級員，對添加益生元的刺梨飲料的色澤、香氣、口感和濁度4個感官指標分別打出分數，總分100分，以確定刺梨飲料的最佳配方。感官評價標準見表3。

1.5 統計分析

利用IBM SPSS Statistics 23軟件，采用Duncan’s新復極差法對各項指標進行統計分析；利用Origin 9.1軟件進行數據整理和作圖。

表3 感官評價表Table 3 Sensory evaluation score of cili juice

2 結果與分析

2.1 脫澀單因素試驗

2.1.1 單寧酶添加量對刺梨果汁單寧含量的影響

探究不同單寧酶添加量對脫除刺梨果汁中單寧的影響，結果如圖1所示。

圖1 單寧酶酶添加量對刺梨果汁單寧含量的影響Fig.1 Effect of tannase dosage on tannin content in cili juice

由圖1可知，隨著單寧酶添加量的增加刺梨果汁中單寧含量呈現先降低后升高的趨勢，添加量小于0.6%時，果汁中單寧含量逐漸減少，單寧水解率逐漸增加；添加量大于0.6%時，果汁中單寧含量增加，單寧水解率降低，且刺梨果汁的特征香氣被酶的氣味覆蓋，這可能是因為不易與酶蛋白結合的單寧遇到比酶蛋白活性強的其他物質時，單寧與這些物質、酶蛋白之間產生競爭[22]。單寧酶添加量為0.4%、0.8%、1.0%的果汁之間單寧含量差異不顯著（P>0.05），但是都顯著高于添加量為0.6%的果汁，且都顯著低于添加量為0.2%的果汁。當單寧酶添加量為0.6%時，刺梨果汁中的單寧含量最低，為30.692 μg/g，與對照組[20]相比單寧脫除率為94.0%，且與各試驗組組間差異均顯著（P＜0.05）。可見，在單寧酶作用下，單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵被水解并生成沒食子酸和葡萄糖，有效降低刺梨果汁中單寧的含量[23]。這與SRIVASTVA等[24]利用固定化處理之后的單寧酶對櫻桃李汁進行處理脫除櫻桃李汁中73.6%單寧物質結果相似。

2.1.2 水解pH值對刺梨果汁單寧含量的影響

探究水解pH值對脫除刺梨果汁中單寧的影響，結果如圖2所示。

圖2 水解pH值對刺梨果汁單寧含量的影響Fig.2 Effect of reaction pH on tannin content in cili juice

由圖2可知，水解pH值介于3.5～5.0之間時，刺梨果汁單寧含量呈先降低后升高的趨勢，水解pH值為3.5和4.0處理的果汁單寧含量相近，單寧含量分別為 107.957 μg/g和 107.275 μg/g，且與 pH 5.5 處理的果汁之間差異不顯著（P>0.05）；當pH值為4.5，單寧酶對刺梨果汁中單寧物質的降解效果達到最佳（P＜0.05），此時單寧含量為64.275 μg/g，單寧脫除率為87.4%。這是由于pH值影響單寧酶的活性，且單寧酶的最適pH值為4.0～6.0[25]，低于或高于最適范圍時單寧酶活力未能達到最大值，水解單寧的能力減弱，單寧脫除率下降。

2.1.3 水解溫度對刺梨果汁單寧含量的影響

探究水解溫度對脫除刺梨果汁中單寧的影響，結果如圖3所示。

由圖3可知，所有樣品中，40℃條件處理的刺梨果汁單寧含量最高，35℃條件處理的刺梨果汁單寧含量次之，其與45、55℃條件處理的結果沒有顯著差異（P>0.05），50℃處理的果汁單寧含量最低（P＜0.05），且與55℃處理的結果之間沒有顯著差異（P>0.05），其它處理結果有著顯著性差異（P＜0.05）。單寧酶作為一種水解酶，需在適宜的溫度和pH值下才能發揮較大作用，并且可能由于溫度過高，刺梨果汁中的一些氧化產物逐漸增加[25-26]，導致55℃處理時單寧含量升高。不同溫度處理單寧，低溫水解會對刺梨果汁中單寧含量產生顯著性影響（P<0.05），單寧含量最低時對應的水解溫度為50℃，此時與對照組[20]相比單寧的脫除率為81.9%。

2.1.4 水解時間對刺梨果汁單寧含量的影響

探究水解時間對脫除刺梨果汁中單寧的影響，結果如圖4所示。

圖4 水解時間對刺梨果汁單寧含量的影響Fig.4 Effect of reaction time on tannin content in cili juice

由圖4可知，從80 min開始，刺梨果汁的單寧含量隨著單寧酶的酶解時間延長先降低后升高，在反應進行100 min時，單寧含量達到最低值64.275 μg/g，與對照組[20]相比單寧脫除率為87.4%，且與其它各組比較差異顯著（P<0.05），時間增長，單寧酶活力逐漸降低，脫除單寧的能力減弱，此結果與羅昱等[27]的研究結果一致。

2.1.5 脫澀單因素試驗的方差分析

對單因素試驗結果進行方差分析，研究各因素對刺梨果汁脫澀效果影響顯著程度，分析結果見表3。

表3 單因素試驗方差分析Table 3 Analysis of variance of single factor experience

由表3可知，單寧酶添加量，水解時間，水解pH值，水解溫度均對刺梨果汁單寧含量影響均達到顯著水平（P<0.05）。故以單寧含量為指標選擇單寧酶添加量、水解時間、水解pH值、水解溫度這4個因素進行正交試驗設計。

2.2 正交試驗結果及分析

根據單因素試驗結果，選擇單寧酶添加量（A），水解時間（B），水解pH值（C），水解溫度（D）作為固定因子，以單寧含量為因變量，利用IBM SPSS Statistics 23軟件設計四因素三水平的正交試驗，試驗設計和結果見表4。

表4 單寧酶脫除刺梨汁中單寧L9（43）正交試驗及結果Table 4 Orthogonal array design and results for the optimization of tannion removal with tannase

各因素對單寧含量的影響可通過極差分析中的R值評價，R值越大，說明對單寧含量的影響越顯著，影響單寧含量的主次因子依次為B>D>C>A，即水解溫度>水解時間>水解pH值>單寧酶添加量，且每個因素的各個水平間大小關系為A1>A2>A3，B2>B3>B1，C1>C3>C2，D2>D3>D1，所以最優組合是：B1D1C2A3，即水解溫度45℃，水解時間80 min，酶作用pH 4.5，單寧酶添加量0.8%，此時脫除單寧效果最佳，刺梨果汁中單寧的脫除率可達到94.37%[27]。

2.3 益生元添加量的優化試驗結果

益生元復配試驗結果如表5所示。

表5 富含益生元的刺梨飲料配方優選試驗結果Table 5 The best test result on formula of cili juice

各處理評分結果如下：P9>P8>P7>P3>P6>P2>P1>P5>P4，可以看出，9種不同的處理所獲得的刺梨果汁中，處理9最好，刺梨果汁的色澤、香氣、滋味都明顯優于其他組，綜合得分為79。影響刺梨果汁風味的主次因子依次為低聚果糖>低聚半乳糖>菊粉，且最優組合為a3b3c1，經驗證，綜合得分高于處理9，因此確定3種益生元的最適添加量為：低聚果糖溶液2.6 g/15 mL、低聚半乳糖溶液3.3 g/15 mL、菊粉溶液2.7 g/15 mL，即低聚果糖4.33 g/100 mL、低聚半乳糖5.5 g/100 mL、菊粉4.5 g/100 mL，產品具有濃郁的刺梨香氣，組織細膩，無糖結晶，酸甜可口，無明顯澀味。這是因為低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉與刺梨中的有機酸復合形成適宜的酸甜比，同時3種益生元之間產生協同效應或對比效應，使得飲料的甜味醇厚，酸甜協調且柔和；若添加量比例不適合，3種益生元或產生對比現象，使得某一味道更加突出而使味覺發生改變[28]。方差分析結果見表6。

由表6方差分析可知，A、B兩因素對指標的影響達到顯著水平（P＜0.05），是影響益生元添加量及刺梨果汁風味的主要因素，而菊粉對其風味無顯著性影響（P＜0.05）。

表6 方差分析結果Table 6 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

3 結論

本文研究了刺梨益生元復合飲料的生產工藝，根據單寧酶能夠有效水解單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵的作用機理，采用單因素試驗和正交試驗法探究單寧酶水解脫除刺梨果汁的澀味物質單寧的最佳條件，確定用單寧酶脫除刺梨原汁中單寧的最佳條件為：單寧酶添加量0.8%，水解溫度45℃，水解pH 4.5，水解時間80 min。以感官評價試驗綜合得分為指標，通過正交試驗法確定富含益生元的刺梨飲料的最佳配比為：最優配方為：刺梨原汁20%，低聚果糖4.33 g/100 mL、低聚半乳糖5.5 g/100 mL、菊粉4.5 g/100 mL，得到的刺梨飲料產品具有刺梨獨特的風味，質地澄清透明，呈現柔和的淡黃色，口感酸甜適宜。

本試驗加工的刺梨飲料不含任何防腐劑，是綜合刺梨果汁、低聚果糖、低聚半乳糖和菊粉功效生產出的一款調節腸道菌群健康的飲品，為益生元在刺梨飲料方面的應用提供了一定的理論參考。