大孔吸附樹脂法吸附桑葚色素及其穩定性研究

許先猛，董文賓，，王芳，張增帥，黃健，3，馬蓉麗

（1.運城職業技術學院，山西運城044000；2.陜西科技大學，陜西西安710021；3.運城學院，山西運城044000）

桑椹（Mulberry），俗稱桑果，含有豐富的多酚類、黃酮類、維生素、有機酸、生物堿和礦物質等活性成分[1]，桑葚及桑葚提取物具有保護肝腎、降血壓、控制肥胖、抗血栓、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒和提高免疫力等功效[2-4]，且桑葚被我國列為“藥食同源”食品。桑葚通體呈黑紫色或紫紅色，紅色素含量較豐富，色價高。近年來，天然色素的開發和研究已成為部分研究學者的關注重點[5]。桑椹紅色素是一種天然色素，因著色效果好，在果酒、果汁、飲料、糖果生產中被廣泛應用。本試驗采用有機溶劑浸提法提取桑葚色素，研究了大孔吸附樹脂法純化桑葚色素工藝，并對制備和純化的桑葚色素穩定性進行了測定，以期為桑葚色素提取、純化和應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑椹：采自山西省運城市桑葚農場。

大孔吸附樹脂：西安藍曉科技有限公司；無水乙醇：天津市紅巖化學試劑廠；檸檬酸：上海化學試劑公司；氫氧化鈉、蔗糖、濃鹽酸：天津市天力化學試劑有限公司；酒石酸：天津市北方天醫化工試劑廠；醋酸：天津市富宇精細化工有限公司；氯化鉀：重慶北培精細化工廠；阿斯巴甜、木糖醇：山東福田科技集團。所有試劑均為分析純。

FD-T-50真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；BS-224型電子天平：德國SARTORIUS公司；722型可見分光光度計、752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發器、SHZ-III循環水多用真空泵：上海亞榮生化儀器廠；HH-Z2恒溫水浴鍋：鄭州長城科工貿有限公司；PHS-3C精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；TDL-5型離心機：上海安亭科學儀器廠；101-1AB電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；HYG-Ⅱa回轉式恒溫調速遙瓶柜：上海欣蕊自動化設備有限公司；微量移液器：芬蘭Dragonmed公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑葚色素提取和大孔吸附樹脂純化

1）桑葚色素提取：取適量桑椹→制漿→準確稱取→加入80%酸性乙醇溶液（pH 2.0），攪拌均勻→50℃避光水浴提取2 h→取上清液，濃縮→醇沉→過濾→真空濃縮→制得桑葚色素溶液（冷藏備用）。

2）桑葚色素大孔吸附樹脂純化：大孔吸附樹脂預處理→桑葚色素吸附→桑葚色素解吸→真空濃縮→冷凍真空干燥→桑葚色素凍干粉（室溫25℃、密封、避光保存備用）。

1.2.2 桑葚色素測定方法

1）pH示差測定法：分別取1 mL桑葚色素溶液樣品置于兩根試管之中，分別加入pH（1.0±0.01）的緩沖溶液與pH 4.5的緩沖溶液，靜置后得到待測液。平行測定 3組，按式（1）和（2）計算桑葚色素濃度[6]。

式中：ε表示矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數，26 900；DF表示稀釋因子；MW表示矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；L表示光程，1 cm。以蒸餾水作為參比，用A700nm來消除樣液混濁的影響。

1.2.3 大孔吸附樹脂的預處理

大孔樹脂預處理參考劉玲翠等[7]方法，稍作改動。分別將選用的9種大孔吸附樹脂LX-60、LX-36、LXA-8、LSA-10、LSA-21、XDA-8、XDA-7、LS305、LS300用無水乙醇密封浸泡24 h，蒸餾水沖洗乙醇，用1 mol/L的NaOH浸泡24 h，蒸餾水洗至中性，用1 mol/L的HCl浸泡24 h，以蒸餾水洗至中性后備用。

1.2.4 桑椹色素吸附率、解吸率及吸附量的計算

桑葚色素吸附率、解吸率和吸附量計算參照李園園等[8]方法，稍作改動。分別準確稱取30.0g預處理后的 9 種大孔吸附樹脂 LX-60、LX-36、LXA-8、LSA-10、LSA-21、XDA-8、XDA-7、LS305、LS300 置于 500 mL 具塞錐形瓶中，分別加入200 mL已知濃度的色素溶液，避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩4 h，過濾后，記錄溶液體積，并測定其吸光度計算桑葚色素濃度。

將吸附色素的樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL的80%乙醇，避光和密封處理，30℃下70 r/min解吸振蕩60 min，過濾后，記錄溶液體積，并測定其吸光度計算桑葚色素濃度。

桑椹色素吸附率、解吸率及吸附量用以下公式計算：

式中：C0表示吸附液中色素濃度，mg/L；V0表示吸附液體積，L；C1表示吸附后上清液中色素濃度，mg/L；V1表示上清液體積，L；C2表示洗脫液中色素濃度，mg/L；V2表示洗脫液體積，L。

1.2.5 桑葚色素大孔樹脂吸附

1.2.5.1 桑葚色素大孔樹脂吸附單因素試驗考察

選取大孔樹脂吸附時間、桑葚色素解吸乙醇濃度、桑葚色素解吸時間、解吸次數等單因素進行試驗，考察各因素對桑葚色素吸附量的影響。

1.2.5.2 桑葚色素大孔樹脂吸附正交試驗考察

對吸附時間、解吸乙醇濃度、解吸時間、解吸次數4個因素進行正交試驗，選取3個水平，采用L9（34）設計正交試驗進行條件優化。試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors of the orthogonal test

1.2.6 桑葚色素穩定性研究

1.2.6.1 pH值對桑椹色素穩定性的研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，用蒸餾水溶解制備0.1mg/mL桑葚色素溶液，分別用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH 溶液調節 pH 值分別為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 的桑葚色素溶液，靜置 70 min后，掃描在200 nm～800 nm波長范圍內不同pH值條件下桑葚色素最大吸收峰。

1.2.6.2 光照對桑椹色素穩定性研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，用蒸餾水溶解制備0.1 mg/mL桑葚色素溶液，室溫（25℃）常光下靜置5 d，每天測定色素含量。

1.2.6.3 溫度對桑椹色素穩定性研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，用蒸餾水溶解制備0.1 mg/mL桑葚色素溶液，將桑椹色素溶液分別置于 20、40、60、80、100 ℃水浴中加熱 5 h，每隔 1 h 測定色素含量。

1.2.6.4 甜味劑對桑椹色素穩定性研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，分別溶解在濃度為的10%蔗糖、3.5%木糖醇、0.3%阿斯巴甜溶液中，制備0.1 mg/mL桑葚色素溶液，蒸餾水作對照，室溫（25℃）避光靜置5 d，每天測定色素含量。

1.2.6.5 酸味劑對桑椹色素穩定性研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，分別溶解在濃度為2%的醋酸、2%檸檬酸、1%酒石酸溶液中，制備0.1 mg/mL桑葚色素溶液，蒸餾水作對照，室溫（25℃）避光靜置5 d，每天測定色素含量。

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 大孔吸附樹脂篩選

2.1.1 不同種類大孔吸附樹脂對桑葚色素的吸附效果

在30℃、避光、密封、搖床轉速為70 r/min條件下，LX-60、LX-36、LXA-8、LSA-10、LSA-21、XDA-8、XDA-7、LS305、LS300等9種大孔吸附樹脂對桑葚色素吸附4 h，大孔樹脂吸附率如圖1所示。

圖1 不同大孔吸附樹脂吸附率Fig.1 The adsorption of different macroporous

由圖 1 可以看出，LX-36、LSA-21、XDA-8、LS-305，4種大孔吸附樹脂對桑葚色素吸附率較高，吸附率都超過了90%。

2.1.2 不同種類大孔吸附樹脂對桑葚色素的解吸效果

在30℃、避光、密封、搖床轉速為70 r/min條件下，用80%乙醇溶液解吸附60 min，大孔吸附樹脂解吸率如圖2所示。

由圖 2 可以看出，LXA-8、LSA-21、XDA-8，3 種大孔樹脂對桑葚色素解吸率較高，解吸率都超過了90%。

2.1.3 不同種類大孔吸附樹脂對桑葚色素吸附量

大孔樹脂對桑葚色素吸附量如圖3所示。

由圖3可以看出，XDA-8吸附量最高，其吸附量為1.81 mg/g。

圖2 不同大孔吸附樹脂解吸率Fig.2 The desorption of different macroporous

圖3 不同大孔吸附樹脂吸附量Fig.3 The adsorption capacity of different macroporous

綜合考慮 LX-60、LX-36、LXA-8、LSA-10、LSA-21、XDA-8、XDA-7、LS305、LS300 等 9 種大孔吸附樹脂對桑葚色素的吸附率、解吸率和吸附量3個因素，大孔吸附樹脂XDA-8效果最好。桑葚色素主要成分為極性物質，在極性溶液中溶解度高，XDA-8大孔吸附樹脂是極性樹脂，因此XDA-8大孔吸附樹脂對桑葚色素吸附效果較為明顯。XDA-8為理想的大孔吸附樹脂，用于桑葚色素的分離和純化。

2.2 桑葚色素大孔吸附樹脂分離純

2.2.1 桑葚色素大孔樹脂吸附單因素試驗

2.2.1.1 吸附時間對桑葚色素吸附量的影響

桑葚色素溶液和XDA-8大孔吸附樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中避光和密封處理，30℃下70r/min分別振蕩吸附 2、4、6、8、10、12 h，過濾，用 80%乙醇在30℃下70 r/min振蕩解吸60 min，桑葚色素吸附量如圖4所示。

圖4 吸附時間對桑葚色素吸附量的影響Fig.4 The influence of adsorption time on the adsorption capacity

由圖4可以看出，震蕩吸附時間對XDA-8大孔吸附樹脂的桑葚色素吸附量影響呈現先上升后趨于平緩的趨勢，震蕩吸附時間超過4 h后，震蕩吸附時間對XDA-8大孔吸附樹脂的桑葚色素吸附量影響不明顯。李瑞琦[9]研究發現，D101大孔吸附樹脂靜態吸附桑葚色素3 h后吸附量趨于平穩，吸附達到飽和，這與本試驗結果基本一致，本試驗選取震蕩吸附時間為4 h。

2.2.1.2 解吸乙醇濃度對桑葚色素吸附量的影響

桑葚色素溶液和XDA-8大孔吸附樹脂置于500mL具塞錐形瓶中避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩吸附4 h，過濾，分別用20%、40%、60%、80%、95%乙醇在30℃下70 r/min振蕩解吸60 min，桑葚色素吸附量如圖5所示。

圖5 解吸乙醇濃度對桑葚色素吸附量影響Fig.5 The influence of desorption ethanol concentration on the adsorption capacity

由圖5可以看出，隨著解吸乙醇濃度的增加，XDA-8大孔吸附樹脂的桑葚色素吸附量影響呈現先上升后下降的趨勢，解吸乙醇濃度80%時XDA-8大孔吸附樹脂的桑葚色素吸附量最高。解吸溶液為極性溶液，隨著解析溶液乙醇濃度的增加解吸溶液極性有所降低，解吸溶液極性介于水和乙醇之間。當乙醇濃度為80%時，解吸溶液極性與桑葚色素極性最為接近，桑葚色素解吸率高，桑葚色素吸附量高，因此本試驗選取解吸乙醇濃度為80%。

2.2.1.3 解吸時間對桑葚色素吸附量的影響

桑葚色素溶液和XDA-8大孔吸附樹脂置于500mL具塞錐形瓶中避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩吸附4 h，過濾，用80%乙醇在30℃下70 r/min分別振蕩解吸 30、60、90、120、150 min，桑葚色素吸附量如圖6所示。

圖6 解吸時間對桑葚色素吸附量影響Fig.6 The influence of desorption time on the adsorption capacity

由圖6可以看出，在大孔吸附樹脂解吸時間為30 min至150 min范圍內，隨著解吸時間的延長，桑葚色素吸附量呈現先增加后平穩的趨勢。解吸時間超過60 min后，繼續延長解吸時間，桑葚色素吸附量基本沒有變化。這是由于大孔吸附樹脂吸附的桑葚色素量是定量，同時解吸溶液的解吸能力有限，解吸時間超過60 min后大孔吸附樹脂中桑葚色素已基本解吸完成，本試驗選取解吸時間為60 min。

2.2.1.4 解吸次數對桑葚色素吸附量的影響

桑葚色素溶液和XDA-8大孔吸附樹脂置于500mL具塞錐形瓶中避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩吸附4 h，過濾，用80%乙醇在30℃下70 r/min振蕩解吸 60 min，分別解吸和震蕩 1、2、3、4、5 次，桑葚色素吸附量如圖7所示。

圖7 不同解吸次數對多酚得率影響Fig.7 The influence of desorption times on the adsorption capacity

由圖7可以看出，隨著解吸次數的增加，桑葚色素吸附量呈現平緩增加的趨勢，不同解吸次數對桑葚色素吸附量影響不明顯。

2.2.2 桑葚色素大孔樹脂吸附正交試驗

在上述單因素試驗基礎上，桑葚色素大孔樹脂吸附正交試驗結果如表2所示。

表2 正交試驗表Table 2 The orthogonal range analysis table

結果顯示，影響桑葚色素吸附量的因素大小依次為 RB＞RC＞RD＞RA，即解吸乙醇濃度＞解吸時間＞解吸次數＞吸附時間，桑葚色素大孔樹脂吸附最佳工藝為A2B2C3D3，即吸附時間為4 h、解吸乙醇濃度為80%、解吸時間為80 min、解吸次數3次。

2.2.3 驗證試驗

準確稱取30.0 g XDA-8大孔吸附樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL色素溶液，避光和密封處理，30℃下70 r/min分別振蕩吸附4 h，過濾。將吸附色素的樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL的80%乙醇，避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩80 min，解吸3次，過濾后，記錄溶液體積，重復3次取平均值。結果表明XDA-8大孔吸附樹脂桑葚色素吸附量為1.89 mg/g。

2.3 桑椹色素穩定性研究

2.3.1 pH對桑椹色素穩定性影響的研究

調整桑葚色素溶液pH值，靜置70min后，在200nm～800 nm波長范圍內掃描桑葚色素最大吸收峰，結果如表3所示。

表3 pH值對桑椹色素穩定性的影響Table 3 Effects of pH on stability of mulberry pigments

由表3可以看出，當桑葚色素溶液pH 1.0和桑葚色素溶液為pH2.0時桑葚色素最大吸收峰在535 nm處，在桑葚色素溶液pH2.0至桑葚色素溶液pH6.0范圍內，隨著pH值的增大，桑葚色素最大吸收峰發生一定位移的紅移。在桑葚色素溶液pH7.0至桑葚色素溶液pH14.0范圍內，桑葚色素無最大吸收峰。這主要是由于桑葚色素溶液pH值升高會導致桑葚色素中花色苷結構改變，pH值超過6.0且繼續升高，花色苷中的黃烊鹽陽離子失去質子，花色苷中的醌式堿不斷增加，花色苷中醌式結構為主體[10-11]。桑葚色素溶液pH值持續升高，還會導致堿式結構出現開環降解[12]。因此，桑葚色素在pH 2.0左右的酸性環境較為穩定。

2.3.2 光照對桑椹色素穩定性研究

將0.1 mg/mL桑葚色素溶液室溫（25℃）常光下靜置5 d，每天測定色素含量，結果如圖8所示。

圖8 光照對桑椹色素穩定性的影響Fig.8 Effects of light on stability of mulberry pigments

由圖8可以看出，桑葚色素在不加入其他試劑的條件下隨著在常光下靜置時間的延長，桑葚色素的含量不斷降低，因此桑葚色素在常光照射下結構不穩定，這與張國棟等[13]研究結果一致，因此桑葚色素保存及應用應注意避光處理。

2.3.3 溫度對桑椹色素穩定性研究

將0.1 mg/mL桑葚色素溶液分別置于20、40、60、80、100℃水浴中，避光加熱5 h，每隔1 h測定色素含量，結果如圖9所示。

圖9 溫度對桑椹色素穩定性的影響Fig.9 Effects of temperature on stability of mulberry pigments

由圖9可以看出，溫度變化對桑葚色素穩定性有一定的影響，在20℃至60℃溫度范圍內，在5 h內溫度對桑葚色素穩影響不大。當溫度為80℃至100℃時，溫度會破壞桑葚色素結構。桑葚色素長時間處于超過80℃溫度下，桑葚色素含量會大幅度降低。

2.3.4 甜味劑對桑椹色素穩定性研究

制備含10%蔗糖、3.5%木糖醇、0.3%阿斯巴甜的0.1 mg/mL桑葚色素溶液，室溫（25℃）避光靜置5 d，每天測定色素含量，結果如圖10所示。

由圖10可以看出，常用的蔗糖、木糖醇、阿斯巴甜等甜味劑在一定的濃度下對桑葚色素穩定性影響不明顯，食品加工過程中甜味劑的正常使用不會對桑葚色素穩定性產生較大影響。

圖10 甜味劑對桑椹色素穩定性的影響Fig.10 Effects of sweeteners on stability of mulberry pigments

2.3.5 酸味劑對桑椹色素穩定性研究

制備含2%的醋酸、2%檸檬酸、1%酒石酸的0.1 mg/mL桑葚色素溶液，室溫（25℃）避光靜置5 d，每天測定色素含量，結果如圖11所示。

圖11 酸味劑對桑椹色素穩定性的影響Fig.11 Effects of acidified agent on stability of mulberry pigments

由圖11可以看出，常用的醋酸、檸檬酸、酒石酸等酸味劑在一定的濃度下對桑葚色素穩定性影響不明顯。桑葚色素在酸性條件下比較穩定，通過酸味劑的添加和使用，可以對桑葚色素起到護色和增色的效果[14]，食品加工過程中酸味劑的正常使用不會對桑葚色素穩定性產生較大影響。

3 結論

大孔吸附樹脂法吸附桑葚色素，效果良好。XDA-8大孔吸附樹脂對桑葚色素吸附率、解吸率和吸附量較高，對桑葚色素吸附量為選取9種大孔吸附樹脂中最高，吸附量為1.89 mg/g。

XDA-8大孔吸附樹脂對桑葚色素，解吸乙醇濃度對吸附量影響最大，解吸時間、解吸次數、吸附時間對吸附量影響逐漸遞減。XDA-8大孔吸附樹脂吸附桑葚色素最優工藝為：準確稱取30.0 g XDA-8大孔吸附樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL色素溶液，避光和密封處理，30℃下70 r/min分別振蕩吸附4 h，過濾。將吸附色素的樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL的80%乙醇，避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩80 min，解吸3次。

桑椹色素穩定性研究表明，pH值、光照和溫度等條件對桑葚色素穩定性影響較大，堿性環境、光照和高溫都會破壞桑葚色素結構。桑葚色素在pH值為2.0左右的酸性環境較為穩定，桑葚色素溶液pH值升高會導致桑葚色素中花色苷結構改變。桑葚色素在低于60℃溫度環境下結構較為穩定，溫度繼續升高桑葚色素結構也會被破壞。常用的蔗糖、木糖醇、阿斯巴甜等甜味劑和常用的醋酸、檸檬酸、酒石酸等酸味劑在一定的濃度下對桑葚色素穩定性沒有明顯影響。