Box-Behnken響應面法優化酶法制備α-環糊精及其分離純化

（漯河食品職業學院食品工程系，河南漯河462000）

環糊精是淀粉通過被芽孢桿菌屬的某些種產生的葡萄糖基轉移酶（α-cyclodextrin glycosyltransferase，α-CGTase）的作用形成的一類環狀低聚糖[1]。比較常見的有α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精，分別由6、7個和8個葡萄糖基構成[2]。在環糊精的應用中，β-環糊精應用廣泛，但在小分子化合物的包合性上，α-環糊精因其空腔更小而比β-環糊精更有優勢。另外，α-環糊精化學性質穩定、有較高的溶解度及在體內代謝慢且無毒等優點，在食品中可作為一種新型的膳食纖維，還可應用于醫藥、化妝品、環保等領域[3-8]。目前，α-環糊精在國外已得到大規模使用，但產量十分有限，國內也基本沒有規模化的生產，究其原因，除了缺少自有高活性的α-環糊精生產關鍵用酶之外，最主要的原因就是生產工藝的不穩定性及很難實現α-環糊精的有效分離。

王寧等[9]利用來源于Paenibacillus macerans的α-CGTase突變體Y89D制備α-環糊精，得到70%的淀粉轉化率。Duan等、冉紅艷等[10-11]將α-CGTase與異淀粉酶復配作用于馬鈴薯淀粉、木薯淀粉，分別得到84.6%和87.15%的α-環糊精轉化率。陳曉彤等[12]采用無有機溶劑的酶法對海洋芽孢桿菌Y112產的α-CGTase制備α-環糊精的3個條件：底物濃度、溫度和pH值進行了優化，得到α-環糊精的轉化率為28.67%。Blackwood等[13]研究了在酶反應體系中加入適當的有機溶劑，可以提高α-環糊精的轉化率。國內大多數研究主要集中在α-CGTase的開發和性質研究上，而α-環糊精的酶法制備及分離工藝卻研究的很少。因此，繼續研究α-環糊精的酶轉化與制備分離工藝對推動α-環糊精的生產和應用具有十分重要的意義。本研究采用有機溶劑的酶法制備α-環糊精，以α-CGTase為催化劑，使其作用于馬鈴薯淀粉，分析不同條件對α-環糊精轉化率的影響，采用響應面法對加酶量、底物濃度、反應時間3個反應條件進行優化，并通過水蒸氣蒸餾法進一步分離純化α-環糊精產物，經高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC 對產物成分進行鑒定，為α-環糊精的規模化生產提供一定的參考依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設備

α-CGTase酶：日本Amano Enzyme公司；α-環糊精、乙腈（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；馬鈴薯淀粉：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純：國藥集團。

V-1800可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；MS-100恒溫混勻儀：杭州奧盛儀器有限公司；PHSJ-5型實驗室pH計：上海儀電科學儀器有限公司；Waters600高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 α-CGTase酶活的測定

采用甲基橙法測定酶的環化活力。將酶液稀釋一定倍數制成粗酶液，用pH 5.5的磷酸鈉緩沖液將馬鈴薯淀粉隔水加熱配制成1.0%的淀粉溶液。在2 mL的離心管中加入100 μL的粗酶液和900 μL的底物。放入恒溫混勻儀中，40℃下反應10 min。取出后加入1 mL 1 mol/L的鹽酸溶液，反應終止。再加入1 mL的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液配制的0.1 mmol/L甲基橙溶液。在20℃下靜置20 min后，測定溶液在507 nm波長下的吸光度。酶活單位（U）的定義為1 min生成1 μmol的α-環糊精所需的酶量。

1.2.2 α-環糊精標準曲線的測定

取6支試管，編號0～5，加入1 mL 0.1 mmol/L甲基橙溶液（用50 mmol/L pH 5.5的磷酸緩沖液配制）和1 mL 1 mol/L 的鹽酸，再依次加入 0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL 1 mg/mL α-環糊精標準溶液（50 mmol/L pH 5.5的磷酸緩沖液配制），立即搖勻，定容至5 mL。16℃恒溫水浴靜置20min后，以0號管調零，在507nm波長下測定吸光度。以吸光度差值為縱坐標，α-環糊精含量為橫坐標繪制標準曲線[14]。吸光度差值（ΔA）=空白溶液吸光度（A1）－樣品吸光度（A2）。

1.2.3 α-環糊精的制備方法

稱取適量的馬鈴薯淀粉加入50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液加熱溶解制成一定濃度的底物溶液，冷卻至25℃。在2 mL的離心管中加入100 μL的粗酶液和900 μL的底物，放入恒溫混勻儀中進行反應。反應結束后，取出離心管置于沸水浴中滅酶10 min。將反應溶液轉移至5 mL離心管中，加入1 mL 1 mol/L的鹽酸溶液。再加入1 mL的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液配制的0.1 mmol/L甲基橙溶液。以相應pH值的磷酸鈉緩沖溶液定容至5 mL，立即搖勻。16℃恒溫水浴靜置20 min后，以空白試劑調零，測定507 nm下的吸光度。

1.2.4 α-環糊精轉化率的計算

式中：w為α-環糊精轉化率，%；x為根據吸光度計算出的α-環糊精的濃度，mg/mL；v1為反應體系溶液的體積，mL；c為反應底物淀粉的濃度，%；v2為反應底物淀粉溶液的體積，mL。

1.2.5 反應條件的優化

1.2.5.1 單因素試驗設計

為系統地考察不同反應條件對α-環糊精轉化率的影響，分別設置不同反應 pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、不同反應溫度（35、40、45、50、55、60℃），確定出最佳的相對酶活條件后，再以不同的底物濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、加酶量（50、100、150、200、250 U/g）、反應時間（8、10、12、14、16、18 h）和 2%不同的有機溶劑（乙醇、異丙醇、正丁醇、正癸醇）進行單因素試驗。

1.2.5.2 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上進行響應面分析，選取加酶量、反應時間、底物濃度為三因子，每個因素選擇包括最佳水平在內的三水平，進行Box-Behnken中心組合試驗。通過響應面分析結果找到最優的反應參數。因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

1.2.6 α-環糊精的分離純化工藝及成分鑒定

反應液→加熱滅酶→混合液過濾、包合物分離、沉淀收集→沉淀復水→水蒸氣蒸餾→蒸發濃縮→晶體析出、過濾干燥→HPLC鑒定分析

經水蒸氣蒸餾去除正癸醇后，獲得α-環糊精溶液，溶液經過濃縮、結晶、干燥，得到α-環糊精產品。

HPLC鑒定環糊精產量及檢測分析條件：將產物滅酶后于12 000 r/min條件下離心25 min，得到的上清液經0.45 μm超濾膜過濾，然后取20 μL上機分析。采用 Thermo Hypersil NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm APS-2 Hypersil微粒），Wasters示差折光檢測器。檢測條件：流動相為75%乙腈水溶液，流速1 mL/min，柱溫30℃。

2 試驗結果與分析

2.1 α-CGTase酶活的測定

通過分光光度法測定酶活，得到α-CGTase的酶活為607 U/g。

2.2 α-環糊精標準曲線的繪制

圖1為α-環糊精的標準曲線。

圖1 α-環糊精標準曲線Fig.1 α-cyclodextrin standard curve

得到α-環糊精的一元線性回歸方程：y=0.073 5x+0.007 3，R2=0.995 6，式中y為507 nm下測定的吸光度，x為濃度，結果表明吸光度與濃度在0.25 mg/mL～1.50 mg/mL之間呈良好的線性關系。

2.3 反應條件對α-環糊精轉化率的影響分析

2.3.1 反應溫度對α-環糊精轉化率的影響

反應溫度對α-環糊精轉化率的影響見圖2。

圖2 反應溫度對α-環糊精轉化率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on α-cyclodextrin conversion

由圖2可以看出，溫度對α-環糊精的制備過程有很大影響，α-環糊精的轉化率隨溫度的升高而增加，當達到50℃時轉化率最高，為38.6%，繼續升高溫度則轉化率急劇下降。這是因為溫度過高，超過最適溫度，α-CGTase部分失活，結構也隨之發生變化，從而造成淀粉轉化率降低。因此選用50℃為最適反應溫度。

2.3.2 反應pH值對α-環糊精轉化率的影響

反應pH值對α-環糊精轉化率的影響見圖3。

圖3 反應pH值對α-環糊精轉化率的影響Fig.3 Effect of reaction pH on α-cyclodextrin conversion

由圖3可以看出，在pH 4.0～5.5之間，隨著pH值的升高，生成的α-環糊精產量也大幅提高，當pH值為5.5時α-環糊精產量最高，為34.7%。隨著pH值的繼續升高，甚至到堿性時，α-環糊精的產量都有所下降。這表明在適宜的pH值下，對酶與底物的結合會有促進作用，導致生成反應的加快，有利于環糊精的產出。而當pH值不在最適范圍內時，會影響酶的構象和結構，導致酶活降低甚至完全失活。因此選用pH 5.5為制備α-環糊精的最適pH值。

2.3.3 底物濃度對α-環糊精轉化率的影響

底物濃度對α-環糊精轉化率的影響見圖4。

圖4 底物濃度對α-環糊精轉化率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on α-cyclodextrin conversion

從圖4可看出，隨著馬鈴薯淀粉濃度的增大，α-環糊精轉化率呈現先上升后下降的趨勢。當底物濃度為1.0%時，α-環糊精的轉化率最高，為27.6%。當α-CGTase的活性部位逐漸被底物分子全部占據時，再增加底物濃度，會抑制酶促反應，導致環糊精的轉化率降低[15]。因此綜合考慮α-環糊精生產的轉化率和環糊精的比例，選用1.0%作為生產α-環糊精的淀粉濃度。

2.3.4 加酶量對α-環糊精轉化率的影響

加酶量對α-環糊精轉化率的影響見圖5。

圖5 加酶量對α-環糊精轉化率的影響Fig.5 Effect of enzyme amount on α-cyclodextrin conversion

由圖5可以看出，隨著加酶量的增加，α-環糊精的轉化率也不斷提高，當加酶量達到200 U/g時，α-環糊精的轉化率最高，為38.0%。隨著加酶量的繼續增加，α-環糊精的產量幾乎不變。其原因是隨著加酶量的增加，增強了α-CGTase的歧化、偶合反應能力，反應體系中的小分子糖濃度也隨著增加，當小分子糖濃度比較高時會促進偶合反應的發生，導致β-環糊精的產量提高，而不利于α-環糊精的生成。因此綜合考慮生產成本和α-環糊精的產量，加酶量選取200 U/g。

2.3.5 反應時間對α-環糊精轉化率的影響

反應時間對α-環糊精轉化率的影響見圖6。

圖6 反應時間對α-環糊精轉化率的影響Fig.6 Effect of reaction time on α-cyclodextrin conversion

由圖6可以看出，隨著反應時間的延長α-環糊精的轉化率先上升后下降，在反應14 h時，α-環糊精的轉化率最高，為34.1%。14 h后，α-環糊精的轉化率大幅降低，其原因可能是隨著反應時間的延長，α-環糊精逐漸產生了分解。因此，選取14 h為最佳反應時間。

2.3.6 有機溶劑種類對α-環糊精轉化率的影響

有機溶劑種類對α-環糊精轉化率的影響見圖7。

圖7 有機溶劑種類對α-環糊精轉化率的影響Fig.7 Effects of organic solvent types on α-cyclodextrin conversion

醇類與環糊精能夠形成包合物沉淀，促進反應向生成環糊精的方向不斷進行，加快反應速度，提高α-環糊精的轉化率[16]。試驗中分別加入了有機溶劑乙醇、異丙醇、正丁醇和正癸醇，從圖7可以看出，反應體系中加入正癸醇后，α-環糊精的轉化率最高，為39.7%。另外由于可溶的醇類會造成后期提取上的困難，因此綜合分析，選用正癸醇作為生產α-環糊精的有機溶劑。

2.4 響應面結果與分析

2.4.1 回歸方程的建立與分析

采用Box-Benhnken進行試驗設計，以底物濃度、加酶量、反應時間為自變量，以α-環糊精的轉化率為響應值，使用Design Expert8.0.6進行三因子三水平響應面分析。其試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 Box-Benhnken試驗設計及響應結果Table 2 Box-Benhnken design and response results values

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression mode

由表3可以看出，該回歸模型p<0.000 1，方程模型極顯著。失擬項p=0.456 9>0.05不顯著，對模型有利；該模型的 R2=0.988 4，R2Adj=0.973 4，CV=0.81%，以上參數說明該模型擬合性好，試驗誤差小。根據回歸系數，得到α-環糊精轉化率的二次多元回歸方程為：

由表3中方差結果可知，對α-環糊精轉化率影響的大小順序為：B加酶量>C反應時間>A底物濃度。其中B加酶量、C反應時間達到極顯著水平，A底物濃度達到顯著水平。二次項A2、B2、C2均極顯著。考察各因素間交互作用，BC存在交互作用，且達到極顯著水平。

2.4.2 因素交互作用響應面分析

根據回歸方程繪制響應面圖，通過觀察響應面的變化情況和稀疏程度可直觀地反映各因素相互作用對α-環糊精轉化率的影響，結果如圖8所示。

由圖8的3個圖可知，加酶量、反應時間和底物濃度對α-環糊精轉化率都有顯著影響。通過對比，圖8（c）的曲面最陡峭、等高線成馬鞍形，表明加酶量B和反應時間C的交互作用對α-環糊精的轉化率影響顯著，與表3分析結果一致。

2.4.3 最佳條件的確定和模型的驗證

圖8 兩因素交互作用對α-環糊精制備的響應面Fig.8 Response surface map of two factors interaction on αcyclodextrin preparation

運用軟件對α-環糊精轉化率的二次多項模型進行預測，選出α-環糊精制備的最佳工藝參數：底物濃度為1.03%、加酶量為206.48 U/g、反應時間為14.83 h，α-環糊精轉化率理論值為40.676 2%。考慮實際情況和可操作性，將最優的工藝參數修正為：底物濃度1.0%、加酶量200 U/g淀粉、反應時間14 h，在此條件下進行3次驗證試驗，取其平均值，試驗制得的α-環糊精轉化率為40.6%，與預測值基本一致，說明了此響應面法得到的回歸模型可靠。

2.5 α-環糊精產物的成分鑒定及分離純化結果分析

α-CGTase作用馬鈴薯淀粉產物成分鑒定見圖9。

圖9 α-CGTase作用馬鈴薯淀粉產物成分鑒定Fig.9 Identification of potato starch products by α-CGTase

如圖9所示，α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精的保留時間分別為8.229、9.492、10.997 min。即當1.0%馬鈴薯淀粉為底物時，添加α-CGTase后得到了含有α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精3種環糊精混合物，其中主要產物為α-環糊精，約占環糊精總含量的75%。

在分離純化中，通過水蒸氣蒸餾法去除包合物沉淀中的正癸醇。經過分析計算，α-環糊精的提取率大致為20%～40%，經過HPLC鑒定產品純度為75%。

3 結論

本文以α-CGTase為催化劑，研究其作用于馬鈴薯淀粉產出α-環糊精的酶法生產及分離工藝。通過單因素試驗分析不同條件對α-環糊精轉化率的影響。試驗結果表明，當α-CGTase的反應溫度為50℃，pH值為5.5時，α-CGTase呈現最好的酶活性質，α-環糊精的轉化率最高。結合響應面法得出制備α-環糊精的最佳工藝參數：1.0%馬鈴薯淀粉，加酶量為200 U/g淀粉，反應時間為14 h，反應體系中加入有機溶劑正癸醇，在此條件下α-環糊精的轉化率為40.6%。

通過水蒸氣蒸餾法進一步分離純化α-環糊精產物，經HPLC檢測鑒定，轉化率可達到20%～40%，純度達到75%。本研究可為α-環糊精的規模化生產提供一定的參考依據。