RP-HPLC法測定樺褐孔菌中紫萁酮含量

張勇，牛俊博，李福森，王晶，劉春明

（長春師范大學中心實驗室，吉林長春130032）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）為大型珍貴藥用真菌，屬于多孔菌科褐臥孔菌，又名白樺茸，主要生長在俄羅斯遠東、北美北部、芬蘭、日本北海道以及我國黑龍江和吉林等地區[1]。藥效作用研究表明，樺褐孔菌具有抗癌、防治糖尿病、抗氧化、抗衰老、降血糖、增強免疫力、防治艾滋病、調節血脂等多種藥理活性[2-3]。據文獻報道，樺褐孔菌中含有多種化學成分，如三萜、酮類、多糖、木質素、生物堿和黑色素類等成分[4-6]。其中，紫萁酮是樺褐孔菌中的主要活性成分，屬于酮類化合物，可以調節血壓、降低膽固醇，對病毒的增殖有明顯的抑制作用[7]，此外，還具有殺死癌細胞和抗氧化的活性[8-10]，其藥理作用廣泛，且在樺褐孔菌中含量較高。目前文獻報道中，主要對樺褐孔菌中某一類成分進行含量分析，如采用紫外分光光度計測定樺褐孔菌粗提物中總多糖、總三萜類化合物等進行含量[11-12]，應用氨基酸分析儀測定其各種氨基酸含量[13]。然而，對樺褐孔菌中紫萁酮這一單體化合物的定量分析還未見報道。中藥質量控制需要對其中的有效成分進行較為準確的定性和定量分析。因此，需要建立能夠準確、迅速檢測樺褐孔菌粗提物中紫萁酮含量測定方法。

本研究以樺褐孔菌中紫萁酮為研究對象，建立反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC） 技術檢測紫萁酮（C10H10O3）[14]（如圖1）含量的分析方法，并對建立的HPLC分析條件進行了方法學考察。同時，采用所建立的方法對不同樺褐孔菌提取物中的紫其酮進行含量測定。

圖1 紫萁酮（osmundancetone）的結構式Fig.1 The structural formula of osmundancetone

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（配DAD檢測器）、柱溫箱采用安捷倫配套裝置（1100）、RP-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美國 Agilent公司；Hei-VAP 型旋轉蒸發儀：德國Heidolph公司；電子分析天平：德國桑塔瑞斯公司；FW-100型高速萬能粉碎機：北京中興偉業儀器有限公司；YoungLin Istrument超純水制備器：韓國YoungLin Istrument公司；KH-250DB型數控超聲波清洗器：昆山禾創超聲儀器有限公司。

樺褐孔菌：吉林省晏達順參業有限公司；甲醇、醋酸（試劑均為色譜純）：加拿大CaledonLaboratoriesLLtd.公司；紫萁酮（Osmundancetone）：成都普思生物科技有限公司；異丙醇、甲醇、乙醇分析試劑：北京化工廠。

2 試驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 不同溶劑提取

分別精密稱取4份樺褐孔菌粉末5.000 1、5.000 4、5.000 5、5.000 8 g，分別加入100 mL的異丙醇、甲醇、95%乙醇、70%乙醇溶液，超聲輔助提取1h。提取液進行抽濾，濾液減壓回收至干，4 mL色譜甲醇溶解，過0.45 μm濾膜，4℃冰箱保存，待用。

2.1.2 不同方法提取

以甲醇為提取溶劑，分別稱取樺褐孔菌粉末（5.000 8、5.000 7、5.000 2 g），分別采用超聲輔助提取1 h、溫度50℃，回流提取1h、溫度80℃，微波輔助提取1 h、功率為180 W。提取物進行抽濾，濾液減壓回收至干4 mL色譜甲醇溶解，過0.45 μm濾膜，4℃冰箱保存，待用。

2.2 標準品溶液的制備

精密稱取紫萁酮對照品0.500 2 mg，加入1 mL的色譜甲醇制成濃度為500 μg/mL的貯備液，過0.45 μm的濾膜，紫萁酮對照品溶液，4℃冰箱保存，待用。

2.3 液相色譜條件

色譜柱 RP-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent，USA）；流動相：A 為甲醇，B 為 0.5%醋酸水，梯度洗脫條件：0～2 min（20%A→20%A），2 min～20 min（20%A→45%A），20 min～40 min（45%A→100%A），40 min～50 min（100%A→20%A）；柱溫：25 ℃；檢測波長：320 nm；流速：0.5 mL/min；進樣量：5 μL。

3 結果分析與討論

3.1 標準曲線的線性關系與范圍

用色譜甲醇進行對紫萁酮標準品溶液進行稀釋，濃度分別為 0.5、1、2.5、4、5 μg/mL，采用 HPLC 檢測，以紫萁酮的濃度（M，μg/mL）為橫坐標，峰面積（S）為縱坐標制作標準曲線（如圖2），得到紫萁酮的回歸方程，S=3 861.3M+42.977，相關系數r=0.999 9，結果表明，紫萁酮在 0.5 μg/mL～5 μg/mL 范圍線性關系良好。

3.2 不同溶劑提取的比較

分別采用異丙醇、95%乙醇、70%乙醇、甲醇作為溶劑，表明甲醇提取樺褐孔菌中紫萁酮有效成分效果較好，基線不平，提取效果雖然沒有顯著差異，但是異丙醇、95%乙醇、70%乙醇溶劑提取有較多雜質。用甲醇作為提取溶劑時，峰面積和峰形大小合適，確定用甲醇作為提取溶劑。用RP-HPLC檢測不同溶劑提取物，如表1所示，結果表明樺褐孔菌的甲醇提取物中紫萁酮含量最高，達到0.107%。

圖2 紫萁酮的標準曲線Fig.2 Standard curve of osmundancetone

表1 不同溶劑對紫萁酮含量的影響Table 1 The effect of different solvents on the content of osmundancetone

3.3 不同提取方法的比較

以甲醇為溶劑，分別采取超聲輔助、回流、微波輔助對樺褐孔菌進行提取，用RP-HPLC分析不同方法提取物中紫萁酮含量，如表2所示。結果表明，不同提取方法對紫萁酮含量的影響不大，但超聲輔助提取操作簡單、方便、快速，提取效率高，超聲輔助提取物中紫萁酮的含量為0.108%。

表2 不同提取方法對紫萁酮含量的影響Table 2 The effect of different extraction methods on the content of osmundancetone

3.4 方法學考察

3.4.1 樺褐孔菌液相圖

采用2.3中HPLC條件下，超聲輔助提取的樺褐孔菌甲醇提取物及紫萁酮標準品均得到較好的分離，結果如圖3所示。

3.4.2 精密度試驗

取2.2對照品溶液，按照2.3的色譜條件重復進樣5次，測定色譜峰面積，以峰面積和保留時間考察精密度，紫萁酮峰面積的RSD為0.24%，紫萁酮保留時間的RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

圖3 樺褐孔菌甲醇提取物及紫萁酮的RP-HPLC圖Fig.3 RP-HPLC chromatograms of Inonotus obliquus methanol extract and osmundancetone

3.4.3 穩定性試驗

選取同一樣品溶液，分別于制備后的0、2、6、10、12、16、24 h，按上述色譜條件進行HPLC測定，不同樣品中紫萁酮的相對峰面積的RSD為0.77%，表明樣品在24 h以內穩定。

3.4.4 重復性試驗

取同一批樺褐孔菌藥材5份，以甲醇為溶劑，超聲輔助提取物法制備樣品溶液，分別應用HPLC進行測定。結果表明，樺褐孔菌中紫萁酮的平均含量為0.105 mg/g，峰面積含量的RSD為0.59%，表明該方法的重復性較好。

3.4.5 回收率試驗

取同一批樺褐孔菌藥材6份，按上述方法制備樣品溶液，加入紫萁酮適量，按照2.3高效液相色譜的條件測定加樣回收率，計算紫萁酮的加樣回收率，結果如表3所示。

表3 平均回收率的測定結果Table 3 Determination of the average recovery

4 結論

本研究利用RP-HPLC法對樺褐孔菌中的紫萁酮成分的含量同時進行測定，分別以異丙醇、95%乙醇、70%乙醇、甲醇作為溶劑，采用超聲、回流、微波方法提取了樺褐孔菌中的紫萁酮有效成分，并用高效液相色譜（HPLC）進行定量分析，檢測了該化合物的含量，結果表明，以甲醇為提取溶劑，超聲輔助提取紫萁酮的效果較好，試驗結果表明該方法和前期處理過程簡便，含量測定結果準確，精密度、穩定性、靈敏度高和重復性良好。目前，樺褐孔菌廣泛用于到保健品和化妝品中，該方法的建立為樺褐孔菌中紫萁酮的有效成分含量的測定和質量控制提供了一定的依據。