不同培養(yǎng)條件對(duì)vero細(xì)胞的增殖及其檢測(cè)病毒含量的影響

吉哈利，王玉恒，于子淇

（西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠，西藏 拉薩 850000）

非洲綠猴腎細(xì)胞（vero細(xì)胞），是一種從非洲綠猴腎上皮細(xì)胞分離出來的異倍體細(xì)胞[1]。1962年，日本學(xué)者Y.Yasumura和Y.Kawakita分離培養(yǎng)出此細(xì)胞系[2，3]，具有生長(zhǎng)速度快、連續(xù)傳代、遺傳穩(wěn)定、對(duì)病毒廣泛適應(yīng)譜等優(yōu)點(diǎn)，也是經(jīng)世界衛(wèi)生組織（World health Organization，WHO）和《中國(guó)藥典》認(rèn)可的應(yīng)用于人用疫苗和動(dòng)物疫苗的細(xì)胞系，故迅速推動(dòng)了該細(xì)胞系應(yīng)用于病毒性疫苗、基因工程疫苗等生物制品。現(xiàn)已廣泛作用于乙型腦炎、輪狀病毒、小反芻獸疫病毒等疫苗的細(xì)胞基質(zhì)[4，6]。因此vero細(xì)胞在生物制品研發(fā)過程中具有非常重要的作用。

迄今為止，對(duì)vero細(xì)胞的培養(yǎng)條件以及在動(dòng)物疫苗研發(fā)等方面的研究越來越多。例如，S.F.Chun等[7]開發(fā)適用于懸浮液的vero細(xì)胞培養(yǎng)工藝技術(shù)，從而有利于病毒疫苗研發(fā)；R.Samia等[8]研究發(fā)現(xiàn)狂犬病毒接種于懸浮培養(yǎng)vero細(xì)胞中可獲得高滴度病毒；Y.Wu等[9]研究發(fā)現(xiàn)了豬流行性腹瀉病毒在vero細(xì)胞多次傳代后可獲得弱毒株；薛俊欣等[10]研究發(fā)現(xiàn)DMSO體積分?jǐn)?shù)低于1%時(shí)對(duì)vero細(xì)胞無明現(xiàn)毒性；韓偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)豬乙型腦炎病毒接種于vero細(xì)胞培養(yǎng)96 h后，可獲得較高滴度的病毒。本試驗(yàn)研究了在不同培養(yǎng)條件下對(duì)vero細(xì)胞增殖及其檢測(cè)病毒含量的影響，初步驗(yàn)證了培養(yǎng)vero細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時(shí)間和最佳血清濃度，為生物制品的研發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞及疫苗來源

Vero細(xì)胞來源于中國(guó)獸藥監(jiān)察所，并經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)至5代后進(jìn)行試驗(yàn)。小反芻獸疫活疫苗（clone 9株）來源于西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠且已獲得國(guó)家批號(hào)，其病毒效價(jià)為103.5 TCID50/頭份。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM （C11960500BT)、PBS緩沖液（C14190500BT）、胰酶（25200-072）、胎牛血清FBS（16000-044）均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，Cell Counting Kit-8（C0037）購(gòu)于北京碧云天生物科技公司，其他分析純均為國(guó)產(chǎn)。二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC，日本三洋電機(jī)株式會(huì)社產(chǎn)品）、體視顯微鏡（CX21FS1C，奧林巴斯工業(yè)有限公司產(chǎn)品）、倒置顯微鏡（DSZ5000X，重慶奧浦光電技術(shù)有限公司產(chǎn)品）、酶標(biāo)分析儀（DNX-9620，北京普朗新技術(shù)有限公司）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL16LMB，湖南星科科學(xué)儀器有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（HH-2A，北京科偉永興儀器有限公司），其他實(shí)驗(yàn)耗材均為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 vero細(xì)胞復(fù)蘇及傳代

從液氮罐中取出凍存vero細(xì)胞，放置于37 ℃恒溫水浴鍋中迅速解凍，吸至已加37 ℃培養(yǎng)液的無菌離心管中，離心后棄掉上清液。重新加入37 ℃培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為4～5×105個(gè)/ml，接種于已加37℃培養(yǎng)液的75cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至75cm2培養(yǎng)瓶壁80%～90 %時(shí)，棄掉上清培養(yǎng)液，用PBS清洗vero細(xì)胞2～3次，除去死細(xì)胞及異物。加入4 ml胰酶放置37℃培養(yǎng)箱消化2～3 min，再加入37℃培養(yǎng)液終止消化，用于接種96孔板。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

Vero細(xì)胞消化后，離心后棄掉上清液，重新加入37℃培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml，接種于96孔板。本試驗(yàn)設(shè)立3個(gè)試驗(yàn)組，分別為DMEM、DMEM+5 %FBS、DMEM+10 %FBS，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，其余孔加入100 ul PBS，于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h。培養(yǎng)到規(guī)定時(shí)間后，細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含10 %CCK-8試劑的細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2.5 h，然后用酶標(biāo)分析儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm時(shí)其吸光度OD值，并計(jì)算重復(fù)孔平均值。

2.3 TCID50測(cè)定

Vero細(xì)胞消化、離心后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml，接種96孔板，于37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h后進(jìn)行同步接毒。本試驗(yàn)設(shè)立兩個(gè)試驗(yàn)組，分別為DMEM+5 %FBS和DMEM+10 %FBS，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。取出待測(cè)活疫苗，按疫苗說明書稀釋疫苗為1頭份，再進(jìn)行10倍梯度稀釋至1×10-4，并設(shè)立陰性對(duì)照，滴加入96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h、96 h、120 h、144 h。培養(yǎng)到規(guī)定時(shí)間后，觀察細(xì)胞病變情況，然后采用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件包中One-way ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SD）表示。

3 結(jié)果

3.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響

為探究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響，因此本試驗(yàn)利用CCK-8方法分別檢測(cè)了vero細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后細(xì)胞增殖的情況。結(jié)果表明：培養(yǎng)時(shí)間的差異對(duì)vero細(xì)胞增殖有顯著作用。由圖1可知，在DMEM培養(yǎng)條件下，vero細(xì)胞培養(yǎng)72 h的細(xì)胞增殖顯著高于培養(yǎng)24 h、48 h，但與培養(yǎng)96 h的細(xì)胞增殖差異不顯著。由圖2可知，在DMEM+5 %FBS培養(yǎng)條件下，vero細(xì)胞的增殖趨勢(shì)呈逐漸遞增，與DMEM培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖趨勢(shì)相同。由圖3可知，在DMEM+10 %FBS培養(yǎng)條件下，vero細(xì)胞培養(yǎng)96 h的細(xì)胞增殖顯著高于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

圖1 在DMEM培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響

圖2 在DMEM+5%FBS培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響

圖3 在DMEM+10%FBS培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響

3.2 不同血清濃度對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響

為探究培養(yǎng)液中血清濃度對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響，因此本試驗(yàn)利用CCK-8方法分別檢測(cè)了vero細(xì)胞在DMEM、DMEM+5 %FBS、DMEM+10 %FBS培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖的情況。結(jié)果表明：在培養(yǎng)液中添加不同濃度的血清對(duì)vero細(xì)胞增殖有顯著作用，其中在vero細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)，不同血清濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響不顯著（見圖4）；在vero細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)，DMEM+5 %FBS組的細(xì)胞增殖顯著高于DMEM組，但與DMEM+10 %FBS組差異不顯著（見圖5）；在vero細(xì)胞分別培養(yǎng)72 h和96 h時(shí)，DMEM+10 %FBS組的細(xì)胞增殖均顯著高于DMEM組、DMEM+ 5 %FBS組（見圖6、圖7）。

圖4 在培養(yǎng)24 h時(shí)，不同血清濃度對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響

圖5 在培養(yǎng)48 h時(shí)，不同血清濃度對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響

圖6 在培養(yǎng)72 h時(shí)，不同血清濃度對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響

表1 不同血清濃度對(duì)vero細(xì)胞檢測(cè)病毒含量的影響

圖7 在培養(yǎng)96 h時(shí)，不同血清濃度對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響

3.3 不同血清濃度對(duì)vero細(xì)胞檢測(cè)病毒含量的影響

為研究培養(yǎng)液中血清濃度對(duì)vero細(xì)胞檢測(cè)病毒含量的影響，因此本試驗(yàn)利用TCID50法計(jì)算vero細(xì)胞在5 %FBS和10 %FBS培養(yǎng)條件下檢測(cè)病毒含量的情況。結(jié)果表明在5 %FBS和10 %FBS培養(yǎng)條件下，vero細(xì)胞檢測(cè)活疫苗TCID50值的差異不顯著（見表1）。

4 討論

Vero細(xì)胞是日本學(xué)者Y.Yasumura和Y.Kawakita于1962年從非洲綠猴腎臟分離的異倍體貼附依賴性細(xì)胞，并培養(yǎng)出細(xì)胞系和不同代次的細(xì)胞庫(kù)[2，3]。1987年，WHO正式批準(zhǔn)vero細(xì)胞系可作為生物制品生產(chǎn)的基質(zhì)，迅速推進(jìn)了人用疫苗和動(dòng)物疫苗的研發(fā)。例如，Barrett等[12]利用vero細(xì)胞生產(chǎn)首個(gè)人用疫苗—脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗；R.Samia等[8]研究發(fā)現(xiàn)狂犬病毒接種于懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞中可獲得高滴度病毒；Y.Wu等[9]研究發(fā)現(xiàn)了豬流行性腹瀉病毒在vero細(xì)胞多次傳代后可獲得弱毒株；薛俊欣等[10]研究發(fā)現(xiàn)DMSO體積分?jǐn)?shù)低于1%時(shí)對(duì)vero細(xì)胞無明現(xiàn)毒性；韓偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)豬乙型腦炎病毒接種于Vero細(xì)胞培養(yǎng)96 h后，可獲得較高滴度的病毒。因此在生物制品研發(fā)過程中vero細(xì)胞具有不可替代的作用。

為了驗(yàn)證vero細(xì)胞的培養(yǎng)條件，因此本試驗(yàn)研究了在不同培養(yǎng)條件下，vero細(xì)胞的增殖及其檢測(cè)病毒含量的情況。首先，通過CCK-8方法檢測(cè)了不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)時(shí)間的差異對(duì)vero細(xì)胞增殖有顯著作用。當(dāng)培養(yǎng)72 h時(shí)的細(xì)胞增殖趨勢(shì)呈逐漸遞增，但72 h之后增殖趨勢(shì)較平緩，也進(jìn)一步說明vero細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間為72 h；然后，利用CCK-8方法檢測(cè)了不同血清濃度對(duì)vero細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明：在培養(yǎng)液中添加不同濃度的血清對(duì)vero細(xì)胞增殖有顯著影響。當(dāng)vero細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)，添加10%血清的細(xì)胞增殖顯著高于不添加血清和添加5%血清，也進(jìn)一步說明vero細(xì)胞最佳血清濃度為10 %；最后利用TCID50法檢測(cè)培養(yǎng)液中血清濃度對(duì)vero細(xì)胞檢測(cè)病毒含量的影響，結(jié)果表明：在添加5%血清和10%血清培養(yǎng)條件下，vero細(xì)胞檢測(cè)活疫苗TCID50值的差異不大，也進(jìn)一步說明vero細(xì)胞檢測(cè)活疫苗病毒含量受培養(yǎng)液血清濃度的影響不大。綜上所述，本試驗(yàn)初步驗(yàn)證了培養(yǎng)vero細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時(shí)間和最佳血清濃度，為生物制品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。