芍藥苷通過促進細胞自噬抑制H2O2誘導的SH-SY5Y細胞的氧化損傷

余婧萍 宋禎彥 李富周 賀春香 成紹武

〔摘要〕 目的 研究芍藥苷對氧化損傷細胞模型的抗氧化作用和細胞自噬的調控作用。方法 以H2O2誘導的SH-SY5Y細胞系構建氧化損傷模型。實驗設對照組，模型組，芍藥苷低、中、高劑量組。采用MTT法檢測芍藥苷干預后細胞存活率;2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測細胞內ROS水平;Ad-mCherry-GFP-LC3B融合蛋白腺病毒檢測細胞自噬水平;Western blot檢測細胞自噬相關蛋白LC3及SQSTM1/p62的表達水平。結果 250 μmol/L H2O2干預24 h后SH-SY5Y細胞存活率約55%為模型復制條件。芍藥苷低、中、高劑量干預后，與模型組比較，細胞存活率呈劑量依賴性上升（P<0.05）。與對照組相比，模型組細胞內ROS水平升高，差異具有統計學意義（P<0.05）;自噬溶酶體形成受阻;LC3Ⅱ及SQSTM1/p62在細胞內表達升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。芍藥苷的干預可促進自噬小體與溶酶體結合;與模型組比較，芍藥苷中、高劑量組細胞內ROS水平顯著下調（P<0.05）;細胞內LC3Ⅱ及SQSTM1/p62的表達降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論 芍藥苷可通過促進細胞自噬改善H2O2誘導的SH-SY5Y細胞氧化損傷。

〔關鍵詞〕 芍藥苷;SH-SY5Y細胞;細胞自噬;LC3;SQSTM1/p62;氧化應激;過氧化氫

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.003

〔Abstract〕 Objective To investigate the antioxidant effect of Paeoniflorin on oxidative damage cell model and the regulation of autophagy. Methods Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay was used to determine the cell activity and to construct the H2O2-induced cell damage model with the optimal time and dose. A control group， model group and low-dose， medium-dose and high-dose paeoniflorin groups were set up. MTT method was used to detect cell viability after PF intervention. 2′，7′-Dichlorofluorescin diacetate （DCFH-DA） was used to detect ROS. Ad mCherry-GFP-LC3B fusion protein was used to detect cell autophagy， and western blot was adopted to detect the expression level of LC3 and SQSTM1/p62 after the intervention. Results After 24 h of intervention with 250 μmol/L H2O2， SH-SY5Y cell viability was about 55%， which was the copy modeling condition. After low， medium and high-dose paeoniflorin intervention on H2O2 damaged cell model， compared with the model group， the cell viability showed a dose-dependent increase （P<0.05）. Compared with the control group， the intracellular ROS level of the model group increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）; autophagolysosome formation was blocked; the expression of LC3Ⅱ and SQSTM1/p62 increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The intervention of paeoniflorin can promote the combination of autophagosomes and lysosomes; compared with the model group， the level of ROS in the cells of the medium and high dose groups was significantly reduced （P<0.05）; the expression of LC3Ⅱ and SQSTM1/p62 was reduced， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Paeoniflorin can improve H2O2-induced oxidative damage of SH-SY5Y cells by promoting autophagy.

〔Keywords〕 paeoniflorin; SH-SY5Y; autophagy; LC3; SQSTM1/p62; oxidative stress; hydrogen peroxide

阿爾茨海默病（Alzheimers disease， AD）是一種嚴重的中樞神經系統退行性疾病，其起病隱匿，與年齡高度相關。臨床上以進行性的認知功能障礙為主要特征，常表現為失語、失用、失認等，嚴重時生活不能自理。據國際阿爾茲海默癥研究協會（Alzheimers Disease International，ADI）估計，世界上每3秒就會多一位癡呆患者，到2030年，全球癡呆患者總數將達到7 500萬，到2050年，將達到1.3億[1]。現已發現大約100種類型的癡呆，其中AD是目前老年人群中最常見的癡呆癥形式。AD對老年人的健康危害極大，已成為世界上第五大死亡原因[2]。隨著人類社會人口老齡化趨勢日漸嚴峻，AD給社會和家庭帶來的影響已經引起人類社會的高度關注。

淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的異常切割導致形成的不溶性β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）在細胞外沉積而形成的老年斑塊以及過度磷酸化的tau蛋白在細胞內形成的神經原纖維纏結（neurofbrillary tangles，NFTs）是AD的主要病理特征。這些毒性物質在腦內積聚引起海馬內嗅皮層和CA1區神經細胞逐漸丟失導致認知功能障礙[3]。研究表明，在AD早期，Aβ沉積和NFTs的形成之前，大腦海馬區存在活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多等氧化損傷特征[4]，且能促進tau蛋白磷酸化和NFTs的形成[5]。氧化應激是由于自由基和活性氧大量表達，氧化程度超出細胞清除能力而導致氧化系統與抗氧化系統失衡引起的。ROS形成是氧正常代謝的天然副產物，并且在細胞信號傳導和體內平衡中具有重要作用，參與細胞的代謝與穩態調節;而過量的ROS累積會引起脂質、蛋白質和核酸的氧化損傷，導致細胞功能障礙和細胞死亡[6]。H2O2是一種非常重要的活性氧，可導致細胞內蛋白、核酸以及脂類代謝產物不同形式的氧化改變，然后觸發細胞死亡[7]。此外，適量ROS可以激活細胞自噬，但大量ROS在細胞內累積會阻礙細胞自噬的發生。AD和自噬之間存在聯系，自噬功能障礙可能會促進AD的發病。研究表明，自噬體的無效降解在AD的病理過程中占有重要作用。通常，自噬泡（autophagic vacuoles，AVs）在正常大腦中很少見，但在AD患者的大腦中卻增加;此外，細胞自噬參與線粒體降解過程以維持細胞能量代謝平衡，研究表明AD腦內存在能量代謝異常可能與自噬-溶酶體途徑異常導致細胞內受損線粒體的降解不足有關[8]。AD早期存在的氧化應激狀態可損傷線粒體功能，線粒體功能障礙可能會進而影響自噬-溶酶體途徑[9]。然而，AD中氧化應激、自噬功能障礙和神經元死亡之間的關系仍不清楚。因此，探索改善AD中氧化損傷及自噬功能障礙的有效藥物對于攻克AD這一世界難題具有較高的臨床應用價值。

漢代的《神農本草經》中有關于白芍的最早記載，為毛茛科植物芍藥的干燥根，具有養血調經，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽之功效。芍藥苷（paeoniflorin）是芍藥或牡丹根皮中提取的水溶性單萜苷，是中藥白芍的主要有效成分之一。研究表明，芍藥苷可改善AD[10]、帕金森氏病[11]、糖尿病性腎病[12]等疾病引起的損傷。芍藥苷對這些疾病的改善作用，可能是與其具有抗炎、抗氧化、調節自噬、改善學習記憶能力的作用相關[13-15]。以往研究結果表明，芍藥苷可通過激活LKB1/AMPK信號通路改善大鼠缺血再灌注（I/R）損傷后的自噬障礙，從而有效緩解腸道I/R損傷[16]。芍藥苷還可改善氧化型低密度脂蛋白抑制的HUVEC細胞的細胞活力，并通過增強自噬改善細胞受損，從而對氧化型低密度脂蛋白誘導的HUVEC細胞的損傷起到保護作用[17]。此外，芍藥苷還能通過自噬相關的鈣蛋白酶/Akt/GSK-3β相關途徑降低tau蛋白的過度磷酸化水平，從而減輕岡田酸對SH-SY5Y細胞的損害。雖然目前關于芍藥苷改善自噬方面的研究已有一定成果，但尚未報道芍藥苷是否可以減輕氧化損傷或氧化應激對AD早期神經細胞的影響，需要進一步研究其潛在分子機制。本實驗采用H2O2誘導SH-SY5Y細胞構建細胞氧化損傷模型并給予不同濃度芍藥苷干預，觀察芍藥苷的抗氧化損傷作用及對細胞自噬的影響，探討芍藥苷調控自噬與改善氧化損傷之間的聯系。

1 材料

1.1 ?細胞

SH-SY5Y細胞株購自中國科學院上海生命科學研究所。SH-SY5Y細胞培養于25 cm2培養瓶中，培養瓶中加入DMEM/F12（1∶1）完全培養基（美國Hyclone公司），置于37 ℃、5%CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）中培養細胞。待細胞融合至80%左右時，用胰蛋白酶-EDTA消化液（中國索萊寶公司）消化細胞，重懸，計數，根據實驗需求將細胞按不同密度接種至孔板中，或將細胞傳代培養。

1.2 ?主要藥物和試劑

芍藥苷（IP0030）、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，M8180）購自中國索萊寶公司;二甲基亞砜（DMSO，D806645）購自中國麥克林公司;過氧化氫溶液（H2O2，323381）、2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，D6883）購自美國Sigma公司;mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒（Ad-mCherry-GFP-LC3B，C3011）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X，P0015L）購自中國Beyotime公司;RIPA裂解液（01408/504074）、蛋白酶抑制劑混合物（CW2200）購自康為世紀生物科技有限公司;BCA蛋白定量分析試劑盒（NCI3227CH）購自美國Thermo Fisher公司;Torin1（S2827）購自Selleck Chemicals公司;小鼠單克隆SQSTM1/p62抗體（ab56416）購自美國Abcam公司;兔多克隆LC3抗體（bs-8878R）和兔多克隆β-actin抗體（bs-0061R）購自北京博奧森生物有限公司;山羊抗兔二抗（AP132P）和山羊抗小鼠二抗（AP124）購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 ?主要儀器

加熱型五段程控金屬浴（北京天根生化科技有限公司）;化學發光凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）;小型臺式離心機、CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）;倒置熒光顯微鏡（德國ZEISS公司）;多功能酶標儀（美國BioTek公司）;共聚焦激光顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 ?建立H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷模型

模型建立步驟參照本課題組前期發表文獻[18]。

2.2 ?實驗分組

待細胞融合至80%左右時，接種細胞：12孔板約1×105個/孔、6孔板約4×105個/孔。將細胞置于培養箱中培養過夜，根據實驗需求給予不同處理，分別設置對照組、模型組（250 μmol/L H2O2）和芍藥苷低（5 μmol/L）、中（10 μmol/L）、高（20 μmol/L）劑量組。

2.3 ?細胞內ROS水平檢測

12孔板中經處理后的細胞，吸棄舊培養基加入工作濃度為1 μmol/L的DCFH-DA的新鮮培養液后，繼續培養30 min，PBS洗3次，使用倒置熒光顯微鏡成像，每組隨機選取5個視野，所采集的圖片使用Image J軟件計算平均熒光強度，以平均熒光強度反應細胞內ROS水平。平均熒光強度=區域熒光強度總和÷區域面積。

2.4 ?細胞自噬水平檢測

使用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染細胞前先通過實驗確定感染細胞所需的病毒量，以不顯著影響細胞生長、熒光較強且便于觀察的感染復數（multiplicity of infection， MOI）值和感染后時間為最佳條件。本實驗的感染條件如下：感染前一天于12孔板中以1×105個/孔接種SH-SY5Y細胞，每孔加入800 μL完全培養基，于培養箱中培養過夜，使第二天感染細胞時細胞密度為50%左右;吸棄舊培養基，加入400 μL新鮮培養基，按MOI值為10計算每孔所需病毒量，加入病毒液。感染24 h之后，棄病毒液，每孔加入800 μL完全培養基，繼續培養24 h后，按照實驗分組設計加入對應藥物，繼續培養24 h后，棄舊培養基，加入4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS洗3次，用抗熒光淬滅劑封片后，使用共聚焦顯微鏡60倍物鏡下掃描成像。通過觀察細胞內綠色斑點（自噬體）與紅色斑點（自噬溶酶體）的表達來評價細胞自噬情況。

2.5 ?Western blot檢測細胞自噬相關蛋白

6孔板中經處理后的細胞，棄舊培養基，PBS輕洗細胞后，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，刮下細胞，將液體和細胞收集至1.5 mL EP管中;使用超聲破碎儀破碎細胞后，于冰上靜置30 min，15 000×g、4 ℃離心10 min，吸取上清液至新的EP管中。BCA法測定蛋白濃度后，調整蛋白濃度至2 μg/μL，100 ℃水浴20 min將蛋白變性，上樣量為20 μg。使用10%丙烯酰胺膠100 V電泳90 min，200 mA濕轉90 min將蛋白轉膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶（TBST 配制）室溫封閉1 h后;一抗SQSTM1/p62、LC3（1∶1 000），β-actin（1∶5 000）4 ℃孵育過夜;TBST 洗膜后;按1∶1 000稀釋SQSTM1/p62、LC3，按1∶5 000稀釋β-actin，4 ℃搖床孵育過夜;TBST洗膜后;按1∶10 000比例稀釋二抗，目的蛋白SQSTM1/p62使用山羊抗小鼠二抗;LC3及β-actin使用山羊抗兔二抗;于37 ℃搖床孵育1 h;TBST洗膜;按1∶1配制顯影液，使用化學發光凝膠成像儀成像;使用Image J軟件進行灰度分析，以SQSTM1/p62或LC3Ⅱ與β-actin的灰度值的比值來進行統計。

2.6 ?統計方法

采用Prism Graphpad 6.0進行數據的統計與分析，計量資料以“x±s”表示，先檢測正態性和方差齊性，方差齊時采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），使用Student-Newman-Keuls進行組間兩兩比較;方差不齊時采用Kruskal-Wallis H檢驗，使用Wilcoxon兩樣本秩和檢驗進行組間兩兩比較。差異性用P值表示，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 ?芍藥苷對SH-SY5Y細胞內ROS水平的影響

ROS熒光成像結果顯示（圖1A），對照組綠色平均熒光強度低，提示細胞內ROS水平較低;經H2O2處理后，模型組綠色平均熒光強度升高，與對照組相比（圖1B、F），差異有統計學意義（P<0.05），提示細胞內ROS水平升高。與模型組相比，芍藥苷干預后，綠色平均熒光強度較模型組減弱（圖1C-F），提示細胞內ROS水平較模型組降低;芍藥苷中劑量、高劑量組綠色平均熒光強度降低有統計學差異（圖1F）（P<0.05），提示芍藥苷中劑量、高劑量組細胞內ROS水平降低，線粒體功能趨于穩定。

3.2 ?芍藥苷對SH-SY5Y細胞自噬水平的影響

Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染后能在靶細胞中表達紅色熒光蛋白（mCherry）、綠色熒光蛋白（GFP）和LC3B的融合蛋白。共聚焦顯微鏡成像結果顯示（圖2），與對照組相比，SH-SY5Y細胞經H2O2處理后，細胞內自噬小體呈綠色熒光，提示自噬體與溶酶體的結合過程受阻。而芍藥苷干預后，細胞內自噬小體呈紅色熒光，提示芍藥苷可促進自噬小體與溶酶體結合，促進細胞自噬進程，且芍藥苷促進細胞自噬呈一定的濃度依賴性。

3.3 ?芍藥苷對自噬相關蛋白的影響

使用mTORC1/2的抑制劑Torin1作為陽性對照，通過Western blot法檢測各組細胞LC3及SQSTM1/p62的表達水平，結果如圖3所示，與正常組相比，模型組細胞經H2O2處理后，LC3Ⅱ、SQSTM1/p62水平升高，提示自噬-溶酶體通路受損;而芍藥苷可在一定程度上逆轉這一過程，改善細胞自噬受損。

4 討論

中醫學認為，癡呆的主要病理機制為腎虛髓虧，腦髓失養，神機失用，以五臟不足為本，血瘀痰阻為標。癡呆的病位在腦，并與心、肝、脾、腎的功能失調密切相關。肝易動難靜，善干他臟，故古有“肝為萬病之賊”之說。肝主疏泄調暢全身氣機;肝失疏泄可影響脾胃氣機，以致生化乏源，心血腎精無處化生，則腦髓失養。此外，肝藏血，腎藏精，肝腎精血同源，肝主疏泄以助精血津液在全身的運行與輸布。若肝血不足，腎精則無以化生;腎精虧損，則無以充養腦髓，腦絡失養。總之，肝正常功能失調會進而累及他臟，最終導致癡呆的發生。通過對老年癡呆用藥相關數據的分析顯示，歸肝經藥物數量位于首位，而癡呆中醫證型的統計表明，“肝腎陰虛證”為癡呆最常見的證型[19]，因此，“治肝”在癡呆的治療中顯得尤為重要。白芍性微寒，入肝、脾經，具有養血柔肝止痛等作用。文獻分析結果顯示，白芍是治療癡呆方劑中的常用藥物，其主要成分為芍藥苷[19-20]。雖然芍藥苷目前已經廣泛應用于神經系統疾病以及神經退行性疾病的基礎研究及臨床治療，但其對AD病理過程的影響機制尚待闡明。

前期研究結果顯示，Aβ的聚集會誘導ROS的產生，芍藥苷可抑制一氧化氮合酶（NOS）的活性，降低ROS水平[21];同時也能抑制Aβ的生成，減少Aβ的聚集[22]。本課題組前期研究結果表明，給予不同濃度芍藥苷干預24 h后，5 μmol/L的芍藥苷可以提高H2O2損傷后的SH-SY5Y細胞的存活率，20 μmol/L的芍藥苷干預達到峰值[23]。本研究的實驗結果顯示，芍藥苷可降低H2O2誘導的SH-SY5Y細胞內ROS的水平，從而可能改善了線粒體的受損狀態，這可能對于改善先于Aβ沉積及NFTs出現的氧化應激對細胞造成的影響具有重要意義。此外，細胞代謝異常能影響β淀粉樣蛋白的生成、積累和Tau蛋白的過度磷酸化，可以加劇線粒體功能障礙和ROS的產生，從而導致惡性循環[24]。芍藥苷可以減少岡田酸誘導的SH-SY5Y細胞中高度磷酸化Tau蛋白的水平，降低自噬相關蛋白LC3Ⅱ的表達[15]。但芍藥苷是否可以通過調控自噬改善氧化損傷對細胞的影響尚未報道。本研究使用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染后，共聚焦成像結果顯示，芍藥苷可促進H2O2損傷后的SH-SY5Y細胞自噬溶酶體的形成。

AD早期存在線粒體功能紊亂，線粒體功能紊亂會導致細胞代謝、鈣離子平衡失調，同時也會導致氧化應激增多，最終導致細胞凋亡。芍藥苷可通過降低ROS及鈣離子的生成，抑制PI3K/Akt信號通路的活性，來抑制細胞凋亡[25-26]。此外，細胞自噬的正常進行對于清除衰老、受損的細胞或細胞器、維持細胞正常功能具有重要意義。盡管ROS是自噬的關鍵誘導劑，但過量產生ROS會抑制自噬。LC3是最早發現的自噬標記物，在細胞內以兩種形式存在，LC3Ⅰ存在于細胞質，LC3Ⅱ定位于自噬體膜，因此，LC3Ⅱ常被作為自噬活性的檢測指標。在自噬體膜形成過程中，LC3前體被Atg4B剪切成LC3Ⅰ，隨后LC3Ⅰ與磷脂乙酰胺（PE）共價結合形成LC3-PE復合物，即膜結合形式的LC3Ⅱ[27]。因此，隨著自噬小體的形成，LC3Ⅱ在自噬體膜的表達會逐漸增加。隨后，自噬體與溶酶體結合成自噬溶酶體并降解，自噬體膜上的LC3Ⅱ會被Atg4B脂化，重新變成LC3Ⅰ[28]。SQSTM1/p62作為自噬受體蛋白在自噬過程中會先與泛素化蛋白結合，再與定位于自噬小體膜上的LC3Ⅱ連接，促進自噬小體的降解，因此在自噬過程中，SQSTM1/p62的水平與自噬水平呈負相關[29]，而當自噬小體與溶酶體形成受阻時，自噬小體的降解受阻，LC3Ⅱ和SQSTM1/p62則會在細胞內累積。我們的結果表明，芍藥苷可通過降低LC3Ⅱ的表達，促進p62蛋白的降解，來促進H2O2損傷后的SH-SY5Y細胞自噬，進而可能在一定程度上改善細胞的狀態。

參考文獻

[1] ALZHEIMER'S DISEASE INTERNATIONAL. World Alzheimer Report 2015—The Global Impact of Dementia [EB/OL]. 2015.

[2] WORLD HEALTH ORGANIZATION. The top 10 causes of death[EB/OL]. 2018-05-24.

[3] SERRANO-POZO A， FROSCH M P， MASLIAH E， et al. Neuropathological alterations in Alzheimer disease[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine， 2011，1（1）：a006189.

[4] GILGUN-SHERKI Y， MELAMED E， OFFEN D. Antioxidant treatment in Alzheimer's disease[J]. Journal of Molecular Neuroscience， 2003，3（21）：1-11.

[5] MONDRAGóN-RODRíGUEZ S， PERRY G， ZHU X， et al. Phosphorylation of tau protein as the link between oxidative stress， mitochondrial dysfunction， and connectivity failure： implications for Alzheimer's disease[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2013， 2013： 940603.

[6] SCANDALIOS J G. Oxidative stress responses-what have genome-scale studies taught us？[J]. Genome Biology， 2002， 3（7）： REVIEWS1019.

[7] KIM J H， CHOI W， LEE J H， et al. Astaxanthin inhibits H2O2-mediated apoptotic cell death in mouse neural progenitor cells via modulation of P38 and MEK signaling pathways[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology， 2009， 19（11）： 1355-1363.

[8] CARDOSO S M， PEREIRA C F， MOREIRA P I， et al. Mitochondrial control of autophagic lysosomal pathway in Alzheimer'sdisease[J]. Experimental Neurology， 2010， 223（2）： 294-298.

[9] SILVA D F， ESTEVES A R， ARDUINO D M， et al. Amyloid-β-induced mitochondrial dysfunction impairs the autophagic lysosomal pathway in a tubulin dependent pathway[J]. Journal of Alzheimer's Disease， 2011， 26（3）： 565-581.

[10] ZHANG H R， PENG J H， CHENG X B， et al. Paeoniflorin atttenuates amyloidogenesis and the inflammatory responses in a transgenic mouse model of alzheimer's disease[J]. Neurochemical Research， 2015， 40（8）： 1583-1592.

[11] LIU H Q， ZHANG W Y， LUO X T， et al. Paeoniflorin attenuates neuroinflammation and dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of Parkinson's disease by activation of adenosine A1 receptor[J]. British Journal of Pharmacology， 2006， 148（3）： 314-325.

[12] SHAO Y X， XU X X， WANG K， et al. Paeoniflorin attenuates incipient diabetic nephropathy in streptozotocin-induced mice by the suppression of the Toll-like receptor-2 signaling pathway[J]. Drug Design， Development and Therapy， 2017， 11： 3221-3233.

[13] 劉漢珍，劉愛榮，李孝良，等.白芍的化學成分及藥理研究進展[J].安徽技術師范學院學報，2001，15（4）：54-57.

[14] 李乃謙.探討白芍的藥理作用及現代研究進展[J].中醫臨床研究，2017，9（20）：137-138.

[15] MA X H， DUAN W J， MO Y S， et al. Neuroprotective effect of paeoniflorin on okadaic acid-induced tau hyperphosphorylation via calpain/Akt/GSK-3β pathway in SH-SY5Y cells[J]. Brain Research， 2018， 1690： 1-11.

[16] WEN J， XU B， SUN Y C， et al. Paeoniflorin protects against intestinal ischemia/reperfusion by activating LKB1/AMPK and promoting autophagy[J]. Pharmacological Research， 2019， 146： 104308.

[17] WANG Y， CHE J B， ZHAO H， et al. Paeoniflorin attenuates oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis and adhesion molecule expression by autophagy enhancement in human umbilical vein endothelial cells[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2019， 120（6）： 9291-9299.

[18] 余婧萍，賀春香，成紹武，等.當歸芍藥散通過調控NF-κB炎性通路改善H2O2誘導的SH-SY5Y細胞氧化損傷的作用[J].中國實驗方劑學雜志，2020，26（10）：1-7.

[19] 司富春，陳 ?瑞.癡呆的中醫證型和方藥規律分析[J].世界中西醫結合雜志，2014，9（10）：1119-1122.

[20] 吳 ?丹.白芍有效成分芍藥苷的測定及其干預膠原誘導性關節炎大鼠的定量蛋白質組學研究[D].長沙：中南大學，2013.

[21] 郭春燕，羅 ?強，孫 ?黎，等.芍藥苷對H2O2誘導SH-SY5Y神經細胞損傷的保護作用[J].2013，44（20）：2864-2871.

[22] 朱 ?燃，黃田喜，趙雪梅，等.10種中草藥成分對體外過表達A？茁的影響及機制探討[J].藥學學報，2014，49（6）：800-806.

[23] 余婧萍，賀春香，李 ?澤，等.芍藥苷對PINK1-Parkin介導的線粒體自噬在H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷中的影響[J/OL].中國中醫藥信息雜志，2020，27（10）：1-7.

[24] T？魻NNIES E， TRUSHINA E. Oxidative stress， synaptic dysfunction， and Alzheimers disease[J]. Journal of Alzheimers Disease， 2017， 57： 1105-1121.

[25] WANG K， ZHU L， ZHU X， et al. Protective effect of paeoniflorin on A？茁25-35-induced SH-SY5Y cell injury by preventing mitochondrial dysfunction[J]. Cellular and Molecular Neurobiology， 2014， 34（2）： 2227-2234.

[26] SUN R， WANG K， WU D， et al. Protective effect of paeoniflorin against glutamate-induced neurotoxicity in PC12 cells via Bcl-2/Bax signal pathway[J]. Folia Neuropathologica， 2012， 50（3）：270-276.

[27] SOU Y S， TANIDA I， KOMATSU M， et al. Phosphatidylserine in addition to phosphatidylethanolamine is an in vitro target of the mammalian Atg8 modifiers， LC3， GABARAP， and GATE-16[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2006， 281（6）： 3017-3024.

[28] ISEI TANIDA T U， KOMINAMI E. LC3 and Autophagy[J]. Methods in Molecular Biology， 2008， 445： 77-88.

[29] LAMARK T， SVENNING S， JOHANSEN T. Regulation of selective autophagy： the p62/SQSTM1 paradigm[J]. Essays in Biochemistry， 2017， 61（6）： 609-624.