膝骨關節炎肝腎虧虛證與寒濕痹阻證的血漿代謝組學差異研究

蘇炳燭 簡功輝 謝青玲 唐曉璐 楊卓 向黎黎 陸小龍 熊輝

〔摘要〕 目的 研究膝骨關節炎（knee osteoarthritis， KOA）肝腎虧虛證與寒濕痹阻證的差異代謝物，探討KOA肝腎虧虛證與寒濕痹阻證辨證差異的物質代謝輪廓。方法 選取KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證患者各30例，采用核磁共振氫譜（1H nuclear magneticresonance spectroscopy，1H-NMR）技術測定血漿中的小分子代謝物，采用主成分分析法和正交偏最小二乘法-判別分析，進行多元統計分析。結果 肝腎虧虛組與寒濕痹阻組血漿樣本有5個差異代謝物有統計學意義（P<0.05），其中高密度脂蛋白、檸檬酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白在肝腎虧虛組患者中含量明顯高于寒濕痹阻組患者，而醋酸、組氨酸含量明顯低于寒濕痹阻組患者。依富集程度（P<0.05）判別代謝通路為乙醛酸和二羥酸代謝、組氨酸代謝、檸檬酸循環、β-丙氨酸代謝、丙酮酸代謝、糖酵解和糖異生。結論 KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證患者存在差異代謝物，分型的差異代謝物質基礎可能是檸檬酸鹽、組氨酸和醋酸。其中醋酸、組氨酸可能為寒濕痹阻證的標志性代謝產物。

〔關鍵詞〕 膝骨關節炎;肝腎虧虛;寒濕痹阻;核磁共振氫譜;代謝組學

〔中圖分類號〕R274.9;R684.3 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.021

〔Abstract〕 Objective To study the difference of metabolites between liver-kidney deficiency syndrome and cold-dampness Bi syndrome in knee osteoarthritis （KOA）， and to explore the material metabolism profile of the difference between liver-kidney deficiency syndrome and cold-dampness Bi syndrome in KOA. Methods The plasma of 30 KOA patients with liver and kidney deficiency syndrome and cold-dampness Bi syndrome were collected. 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy （1H-NMR） technology was applied to determine small molecule metabolites in plasma. Principal component analysis and partial least squares discrimination analysis were performed to conduct multivariate statistical analysis. Results There were 5 different metabolites in the plasma samples of liver and kidney deficiency group and cold-dampness Bi group， with statistical significance （P<0.05）. The contents of high density lipoprotein （HDL）， citrate and low density lipoprotein （LDL）/very low density lipoprotein （VLDL） in patients with liver-kidney deficiency group were significantly higher than those in patients with cold-dampness Bi group， while the contents of acetate and histidine were significantly lower than those in patients with cold-dampness Bi group. According to the enrichment degree （P<0.05）， the metabolic pathway was identified as glyoxylate and dicarboxylate metabolism， histidine metabolism， citrate cycle， β-alanine， pyruvate metabolism， glycolysis/gluconeogenesis. Conclusion There are different metabolites in KOA patients with liver and kidney deficiency syndrome and cold-dampness Bi syndrome. Citrate， histidine and acetate may be the different metabolites of syndrome type. Acetate and histidine may be the iconic metabolites of cold-dampness Bi syndrome.

〔Keywords〕 knee osteoarthritis; deficiency of liver and kidney; cold-dampness Bi syndrome; 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy; metabolomics

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是發生在膝關節的髕股關節或內外側間室的骨性關節炎，由于膝關節軟骨退行性改變，導致軟骨磨損、破壞，伴有關節周圍骨質增生，是一種以軟骨損傷為主的慢性、退行性關節病[1-2]。KOA在中老年人中的發病率較高[3]，中醫學將其歸屬于“痹證”范疇[4]?！白C”是中醫辨證論治的起點與核心，證本質研究具有實際的臨床價值[5]。代謝組學可作為中醫證候研究的一種技術手段[6]。本研究采用核磁共振氫譜（1H nuclearmagnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）檢測技術分析KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證患者血漿的代謝產物，尋找KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證的代謝差異物，為“證”的本質差異研究提供物質基礎。

1 對象

1.1 ?一般資料

選取2019年1月至2019年12月就診于湖南中醫藥大學第二附屬醫院的KOA患者，年齡在50～74歲的KOA肝腎虧虛證和寒濕痹阻證患者各30例，其中每組男15例，女15例;肝腎虧虛組，年齡（62.3±8.6）歲，病程（3.4±2.9）年。寒濕痹阻組，年齡（62.2±7.5）歲，病程（3.6±3.3）年。兩組患者性別、年齡、病程比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經湖南中醫藥大學第二附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 ?診斷標準

參照膝骨關節炎中西醫結合診療指南中的診斷標準[7]：（1）近1個月內反復膝關節疼痛;（2）晨僵≤30 min;（3）活動時有骨擦音（感）;（4）中老年患者（≥50歲）;（5）X線檢查（站立或負重位）示關節間隙變窄、軟骨下骨硬化和（或）囊性變、關節緣骨贅形成;（6）MRI示軟骨損傷、骨贅形成、軟骨下骨骨髓水腫和（或）囊性變、半月板退行性撕裂、軟骨部分或全層缺失。滿足診斷標準（1）+（2）+（3）+（4）或（1）+（5）或（1）+（6）條，診斷為KOA。

1.3 ?中醫證候診斷

參照《膝骨關節炎中醫診療專家共識（2015年版）》[4]《膝骨關節炎中西醫結合診療指南》[7]中的證候診斷。（1）寒濕痹阻證 ①主癥：關節疼痛重著、遇冷加劇、得溫則減。②次癥：腰身重痛。③舌象與脈象：舌質淡，苔白膩，脈沉。（2）肝腎虧虛證 ?①主癥：關節隱隱作痛。②次癥：腰膝酸軟無力，酸困疼痛，遇勞更甚。③舌象與脈象：舌質紅，少苔，脈沉細無力。

1.4 ?納入標準

（1）符合上述診斷標準;（2）符合依據“探脈哥智能中醫輔助診療系統（登記號：2020SR0117189）”和上述診療方案的診療標準進行計算機評判后確定的中醫證型標準;（3）近1個月內未曾服用過非甾體抗炎藥、激素等藥物或接受其他治療者;（4）受試者自愿加入本研究方案，并簽署知情同意書。

1.5 ?排除標準

（1）合并類風濕關節炎、色素沉著絨毛結節性滑膜炎、滑膜結核、滑膜軟骨瘤病、痛風性關節炎、創傷性滑膜炎等其他關節疾病患者;（2）合并有嚴重的肺、肝、腎、心腦血管、血液性、代謝性及精神類疾病患者;（3）病人有關節創傷史;（4）接受過激素治療或膝關節局部有破潰、感染、化膿者;（5）孕婦或哺乳期婦女。

2 方法

2.1 ?樣本采集與前處理

患者禁食、禁水12 h以上，采集靜脈血，加入枸櫞酸鈉抗凝劑，離心分離出血漿，離心后將血液封存于EP管中，并標記分組信息及編號。置于-80 ℃冰箱凍存備用。

將預處理后的血漿樣本從-80 ℃冰箱中取出，室溫放置，待其融化后，取200 μL上層清液于離心管中，加入400 μL用重水配制的0.9%氯化鈉溶液（含0.3 mg/mL TSP），渦旋混勻，以13 000 r/min在4 ℃的低溫離心機中離心10 min，離心完成后取上層清液550 μL，加入編號的5 mm核磁管中，并將其放入4 ℃冰箱，于24 h內進行NMR檢測。

2.2 ?NMR采集

血漿樣本的1H-NMR譜圖采集在Bruker AVANCE Ⅲ 600 MHz超導核磁共振波譜儀上進行，為了測定血漿中的小分子代謝物，采用弛豫編輯（Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG）脈沖序列對樣品進行測定，實驗參數如下：譜寬20.0 ppm，采集點數64 K，弛豫延遲2 s，累加次數128次，90°脈沖寬度12 μs，采集時間1.36 s。所有實驗均在5 mm多核寬帶觀測（BBO）的探頭上進行，測試溫度維持在298 K。采用Topspin 3.5軟件對采集的原始譜圖進行傅立葉變換以及基線校正、相位調整，并將TSP作為化學位移的參考峰，定為0 δ ppm。使用MestReNova 12.0 軟件對核磁譜圖進行處理，將0.5～9.5 ppm 區域內譜圖以0.004 ppm為單位進行分段積分，并去除4.77～5.20 ppm區域殘余水峰信號。所得積分值按每張圖譜的總積分面積進行歸一化處理，數據最終在Excel 2010軟件上以CSV格式保存。

2.3 ?數據分析

采用SIMCA-P 14.1軟件（Umetrics AB， Umea， Sweden）對歸一化后的數據進行多元數據分析。為了從總體上反映兩組樣本之間的代謝差異和組內樣本之間的變異度的大小，對數據采用中心化換算的數據標準化方式預處理之后，進行主成分分析（principal component analysis， PCA）。此外，為了消除個體差異、年齡、性別等相關因素對分組的影響，強化組間差異，確定差異代謝物，對數據進行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA），并將OPLS-DA模型中的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值>1.0作為差異代謝物篩選的重要標準之一。

3 結果與分析

3.1 ?肝腎虧虛組與寒濕痹阻組KOA患者血漿樣本的PCA、OPLS-DA分析

兩組血漿樣本PCA分析共獲得個7主成分，累積R2X=0.482，Q2=0.137，PCA得分圖結果如圖1所示。結果顯示：模型中的主成分積分值集中分布于散點圖（95%的置信區域內）的4個區域中，說明肝腎虧虛組與寒濕痹阻組患者中的代謝物存在差異。兩組樣本OPLS-DA分析模型（R2X=0.31，R2Y=0.966，Q2=0.197）得分圖如圖2所示。結果顯示：兩組樣品在t[1]維較好地分開，說明組間差異有統計學意義。

3.2 ?肝腎虧虛組與寒濕痹阻組KOA患者血漿樣本OPLS-DA的相關系數負載

肝腎虧虛組與寒濕痹阻組血漿樣本OPLS-DA的相關系數負載圖3可以直觀看出使得兩組樣本存在的代謝物。結合OPLS-DA模型對潛在生物標志物進行篩選鑒定，最終得到5個差異代謝物（P<0.05），其結果如表1所示。結果表明：高密度脂蛋白、檸檬酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、組氨酸在肝腎虧虛組患者中含量明顯高于寒濕痹阻組患者，而醋酸鹽含量明顯低于寒濕痹阻組患者。見圖3。

3.3 ?肝腎虧虛組與寒濕痹阻組KOA患者血漿樣本中差異物質通路歸屬

通路分析采用MetaboAnalyst v.2.0（www.metaboanalyst.ca）進行，以富集程度（P<0.05，P值越低表明富集程度越高）判別代謝通路其結果如表2所示。最終發現肝腎虧虛組與寒濕痹阻組主要差別（P<0.05）在于乙醛酸和二羥酸代謝、組氨酸代謝、檸檬酸循環（TCA循環）、β-丙氨酸代謝、丙酮酸代謝、糖酵解和糖異生。

4 討論

“證”是對疾病發展過程中某一階段病機特點的整體概括，“證”具有“階段性”和“非特異性”[8]。代謝組學從微觀上，研究機體代謝進程中所有代謝物的變化規律[9]。二者的思路和方法都是研究機體的特定“狀態”，表現為體液中內源性成分的變化，并以組、群、譜的特征出現[10]。KOA病理主要與軟骨代謝相關，涉及到其他組織如滑膜[11]、韌帶以及軟骨下骨的變化[2]。本研究發現，兩組血清樣本代謝物存在差異，有統計學意義。

4.1 ?相關代謝物參與的KOA發病機制之間的關聯性推斷

高密度脂蛋白（HDL）升高可見于KOA患者，絕經后女性KOA骨量[12]與HDL呈正相關，可能是引起軟骨下骨改變的原因。羅緒林等[13]應用針刀結合手法干預KOA病人發現其機制可能是通過干預的脂質和HDL代謝來達到治療作用。

低密度脂蛋白（LDL）是由極低密度脂蛋白轉變而來，LDL被氧化能夠促進軟骨骨贅形成、促進炎癥反應及加速軟骨細胞凋亡[14]。LDL被氧化修飾而成的脂質過氧化產物，在關節軟骨的退變中起到核心的促進作用，是KOA病情診斷的標志物之一[15]。

醋酸，是一種有機一元酸，典型的脂肪酸。有研究表明應用關節腔注射碘乙酸可建立大鼠骨關節炎模型，并且隨著劑量的加大關節損傷越嚴重[16]。乙酸可致小鼠疼痛出現扭體反應，已成為常規鎮痛藥物篩選方法。

檸檬酸是脂肪、蛋白質及糖三大能量物質轉化的核心環節，是有氧代謝過程的中心代謝途徑，是機體獲得能量的主要方式，其可能與關節軟骨及導致線粒體功能障礙相關[17]。

組氨酸能在組氨酸脫羧酶的作用下脫羧形成組胺，組胺具有很強的血管舒張作用，并與多種變態反應及炎癥有關[18]。組氨酸與氧化損傷有關，是活性氧自由基的直接清除劑，降低關節內氧自由基的水平，可減輕關節軟骨的損傷[19-20]。

根據差異代謝產物與主要代謝通路間關系，組氨酸主要參與了β-丙氨酸、組氨酸代謝。醋酸主要參與了丙酮酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、糖酵解和糖異生。檸檬酸主要參與了TCA循環、乙醛酸和二羧酸代謝。6條通路主要與3個代謝產物相關，在機體能量代謝過程中發揮重要作用。

4.2 ?差異代謝物參與的KOA證型之間的關聯性推斷

虛實是辨別人體正氣強弱和病邪盛衰的兩個綱領。實證主要取決于邪盛方面，而虛證主要取決于正虛方面。肝腎虧虛證屬虛癥，寒濕痹阻證屬實證。二者差異代謝物及代謝通路提示能量代謝的差異。肝腎虧虛證處于相對能量不足狀態，可導致氣血運行不足，這與肝腎虧虛證患者常伴有腰膝酸軟乏力等有關。

檸檬酸多與能量相關。在肝腎虧虛證患者中含量明顯高于寒濕痹阻證患者，其代謝差異可能是由于不能被中心體充分利用，進而導致代謝物堆積。差異代謝物在肝腎虧虛證患者中明顯增多，提示可能由于其證候本身的虛實所導致。

實證疼痛多劇烈，乙酸致小鼠扭體反應模型可以模擬腹腔炎癥引起的腹痛癥狀，其在寒濕痹阻組較高。與寒濕痹阻證和肝腎虧虛的臨床疼痛癥狀差異相符合。應用細辛提取物可顯著降低乙酸導致小鼠扭體的扭體次數[21]。細辛性味辛溫，有散寒功效，熱藥治寒提示醋酸可能為寒濕痹阻證的標志性代謝產物。骨內高壓與骨內血流動力學異常有關，可致KOA的發生[22]?？蒲兄谐Ｓ媒Y扎供給血管造模[17]。溫熱方藥能改善因寒邪導致的器官血流動力學異常，增加其血液灌注[23]。組氨酸與血管收縮相關，本次研究提示其在寒濕痹阻證患者較高，推測其可能為寒濕痹阻證的特異性代謝產物。

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