寧夏水稻種質資源主要抗稻瘟病基因的鑒定和評價

張銀霞 ，沈文娟 ，韓雪琴，張振海，田 蕾 ，楊淑琴 ，羅成科，李培富(.寧夏大學 農學院，銀川 7500； .寧夏回族自治區原種場，銀川 75000；

3.寧夏農林科學院 農作物研究所，寧夏永寧 750105)

水稻(Oryzasativa)是重要的糧食作物，而被稱為“水稻癌癥”的稻瘟病會使水稻大幅度減產甚至絕收，是全球糧食安全的重大隱患。據全國農作物重大病蟲害預警，2018年稻瘟病在中國的發病面積為7500萬畝次，較2017年偏重流行[1]。在寧夏地區稻瘟病是常發性病害，也是重要的病害之一，嚴重威脅著水稻的產量和品質。對水稻新品種的培育來說，抗病基因的利用是抗病育種的基礎和核心。抗性基因可操作性強、效果明顯，因此，人們在很早以前就開始開展主要抗性基因的鑒定及其應用研究。Piz和Pik是水稻中目前報道含有廣譜高抗稻瘟病最多的2個位點，它們分別包含Pi2、Pi9、Pizt和Pi1、Pikh、Pikm復等位基因[2-4]。Pita和Pib在中國很多稻區也表現出很高水平的抗性[5-6]，但這些位點或基因在國內品種資源中的分布及利用還缺乏完善的研究，限制了它們在育種中的應用。針對寧夏地區近幾年選育的水稻新品種對稻瘟病抗性較低或僅能達到中抗，而全國各地都已實施新品種審定稻瘟病“一票否決制”，所以本研究擬采用已克隆抗稻瘟病基因的功能標記對寧夏水稻種質資源進行分子掃描，結合稻瘟病抗性的人工接種鑒定和自然誘發鑒定，進而開展稻瘟病抗性與抗性基因的關聯分析，確定寧夏水稻抗稻瘟病的主要基因，揭示寧夏水稻抗稻瘟病的遺傳基礎。在此基礎上，對主要抗病基因在寧夏水稻品種中的應用進行評價，以期為抗病品種的應用及抗病基因的分子標記輔助選擇育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試水稻材料 以143份寧夏水稻種質資源(98份寧夏自育水稻品種和45份雜交后代)作為試驗材料。

1.1.2 供試稻瘟病菌菌株 供試稻瘟病菌菌株由寧夏大學農學院植保實驗室李文強老師提供，是從寧夏各水稻種植區收集到的致病性強且致病力頻率高的稻瘟病菌經過單胞分離純化后的菌株，如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 寧夏水稻種質資源稻瘟病抗性的鑒定水稻材料在寧夏大學水稻育種基地種植，每個材料種植2行，每行10株，株距10 cm，行距26 cm，每隔2行種植1行誘發行(楊和白皮稻)。在水稻分蘗期采用人工接種和自然誘發相結合的方法進行稻瘟病抗性鑒定。在分蘗初期和盛期調查3次葉瘟，在抽穗期及黃熟期調查2次穗瘟。葉瘟的調查在每個小區以發病最重的2～3株的平均發病等級作為該品種的抗性級別，穗瘟的調查在每個小區隨機抽查10株，記錄發病率和病級。稻瘟病發病情況按照國際水稻所(IRRI)稻瘟病抗性評價葉瘟分級標準。抗性評價值越大，越容易感病。具體分級見水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術規程中的水稻稻瘟病抗性綜合評價分級標準[7](高抗<0.1，抗0.1～2.0，中抗4.1～6.0，感6.1～7.5，高感7.5～9.0)。

表1 供試稻瘟病菌菌株Table 1 Rice blast strains in this study

1.2.2 寧夏水稻種質資源抗稻瘟病基因的分子掃描 引物合成：PCR特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司合成，序列見表2。

表2 稻瘟病抗性基因引物序列Table 2 Gene primer sequence of rice blast resistance

寧夏水稻種質資源基因組DNA的提取及擴增：采用改良SDS法提取水稻基因組DNA，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量和濃度[8]。然后以DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為20 μL，包含PCR緩沖液10×Buffer(25 mmol/L、含Mg2+)2.0 μL， dNTP(2.5 mol/mL)0.4 μL，引物( 4 pmol/L) 2.0 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U /μL) 0.2 μL，模板DNA(約15 ng /L)2.0 μL，最后用ddH2O補足20 μL。

PCR擴增反應程序：94 ℃，5 min；35個循環；94 ℃，45 s，退火溫度依據引物說明而定， 72 ℃，1.5 min；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，核酸染料染色，在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 寧夏水稻種質資源稻瘟病抗性的鑒定

依照國際水稻所稻瘟病發病級別的標準對寧夏水稻種質資源進行抗性鑒定。結果發現寧夏水稻種質資源對本地區的稻瘟病以中抗和中感的材料居多。少數材料表現為感病和抗病。其鑒定結果如表3所示。

表3 寧夏水稻種質資源稻瘟病抗性鑒定結果Table 3 Performance of rice blast resistance of rice germplasm resources in Ningxia

(續表3 Continued table 3)

2.2 寧夏水稻種質資源抗稻瘟病基因的分子 檢測

利用已克隆的抗稻瘟病基因Pita、Pikh、Pib、Pi2、Pikm、Pi9、Pi5、Pid2的功能標記對寧夏水稻種質資源進行分子掃描，結果發現在寧夏水稻種質資源中均檢測到了抗稻瘟病基因，其數量從1個到6個不等。其中最多的有6個基因，分布在‘寧粳25號’‘寧粳28號’‘寧粳36號’‘花119’等。最少的是1個基因，分布在‘寧粳42號’‘大琥板稻’(表4)。基因數量相同的不同種質的抗性存在差異，說明稻瘟病抗性基因之間存在互作關系。部分PCR分子檢測結果如圖1和表4所示。

M.100 bp Ladder;1.寧粳3號；2.寧粳7號；3.寧粳9號；4.寧粳12號；5.寧粳14號；6.寧粳15號；7.寧粳16號；8.寧粳18號；9.寧粳19號；10.寧粳23號；11.寧粳24號；12.寧粳25號；13.寧粳26號；14.寧粳27號；15.寧粳28號；16.寧粳31號；17.寧粳32號；18.寧粳33號；19.寧粳34號；20.寧粳35號；21.寧粳36號；22.寧粳37號；23.寧粳38號；24.寧粳39號

2.3 寧夏水稻種質資源主要抗稻瘟病基因的分析

通過對抗稻瘟病基因在寧夏水稻種質資源中的抗性分布分析，發現含有Pid2基因的供試材料有90.91%的抗性達到中抗且沒有發現感病材料，顯著的高于其他基因組合的供試材料。含有Pita、Pikm、Pi9、Pi5、Pi2基因的供試材料分別有1.19%、0.91%、1.69%、1.35%、1.54%的抗性能夠達到抗稻瘟病，其中含有Pikm基因的材料中沒有發現感病材料，中感的比例也比較低，含有Pi9、Pi5、Pi2基因的供試材料沒有發現感病材料(圖2)。所以在抗稻瘟病分子標記輔助選擇育種中Pikm、Pi9、Pi5、Pi2和Pid2是首選基因，可以作為寧夏水稻抗病性育種的優勢基因。而含有Pita和Pib基因的材料發現感病材料，中感的材料比例也比較高，所以在抗病性品種選育中不可取。

2.4 主要抗稻瘟病基因在寧夏水稻種質資源中的分析

由圖3可以看出，在寧夏水稻育種中表現優勢的抗稻瘟病基因Pikm、Pi9、Pi5、和Pid2在寧夏水稻種質資源中的分布頻率分別是0.56、 0.35、0.30和0.11，占的比例相對比較低。可見，在抗稻瘟病育種中應注意充分利用抗稻瘟病基因尤其是Pikm、Pid2和Pi9位點的相關基因。

表4 抗稻瘟病基因的分子檢測結果Table 4 Molecular marker-assisted detection of blast resistance genes

(續表4 Continued table 4)

(續表4 Continued table 4)

(續表4 Continued table 4)

圖2 抗稻瘟病基因在供試材料中的抗性分布Fig.2 Distribution of resistance gene to rice blast in tested materials

3 討 論

目前水稻抗稻瘟病分子育種盡管取得了顯著的成效，但是不同抗稻瘟病基因對田間哪些稻瘟病致病性菌株起作用難以預測，導致育種家在選育過程中難以選出相應的抗性基因[9]。如果明確了某一特定區域內多個抗稻瘟病基因的抗性和水稻品種中含有的抗稻瘟病基因類型，那么開展水稻抗稻瘟病新品種選育和品種抗性布局工作就有基礎和理論指導。在水稻稻瘟病抗性基因評價方面，已陸續報道的抗性基因有84個[10]。李進斌等[11]分析了22個抗瘟基因在云南省3個稻區的抗性，確定了Pi9和Piz5的高抗地位；劉文德等[12]分析了24個抗瘟基因在福建省的抗性，Pikh抗性最強，抗譜達98.15%，Pi-1和Pi-9抗譜也較高，是優質抗源。寧夏水稻種質資源經抗稻瘟病基因的功能標記分子檢測發現攜帶抗稻瘟病基因數可以達到6個[13]，但起主要作用的抗瘟基因尚不清楚。通過本研究發現在寧夏這個特殊氣候和地理環境條件下，Pikm、Pi9、Pi5、和Pid2抗稻瘟病基因發揮著主要的作用，尤其Pikm抗性基因在供試材料中占了56%，能達到中抗的材料80.91%，充分說明了此基因的主要作用。何琳等[14]、薛清芝等[15]利用SSR分子標記分別對抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-15(t)進行檢測，明確了部分水稻品種攜帶此基因的情況；時克等[16]利用Pi-ta和Pi-b抗稻瘟病基因序列內的功能標記對58份水稻品種進行了檢測，明確了其在當地的分布情況。本研究在確定了寧夏地區主要抗稻瘟病基因的基礎上，對其在寧夏水稻種質資源中的分布做了評價，發現發揮主要作用的抗性基因分布頻率比較低，尤其Pid2抗稻瘟病基因僅占11%。但此抗性基因的抗性可達到90.91%。因此，為了加速抗稻瘟病基因的分子標記輔助選擇育種，發掘和鑒定廣譜持久抗稻瘟病基因，將其安全滲入或聚合到綜合性狀優良的水稻材料中是重要的基礎。

圖3 抗稻瘟病基因在寧夏水稻種質資源中的頻率分布Fig.3 Frequency distribution of rice blast resistance genes in Ningxia rice germelasm resources