基于SLAF-seq技術的山西省地方梨品種的SNP分析

白牡丹，郝國偉，張曉偉，楊 盛，郭黃萍

(山西省農業科學院 果樹研究所/果樹種質創制與利用山西省重點實驗室，太原 030031)

山西省是中國梨的主要產區之一，栽培范圍廣，在栽培過程中已演化出豐富的梨種質資源，如‘金梨’‘黃梨’‘小白梨’和‘油梨’等品質優良的地方品種。了解這些地方梨品種的群體結構和親緣關系，對山西省梨資源的搜集、保護及利用都具有重要的指導意義。

目前，DNA分子標記技術已廣泛應用于物種進化分類、基因組研究、遺傳學和分子分類學等許多研究領域[1-4]。其中，以SNP為代表的第三代分子標記技術，在分子遺傳圖譜構建、遺傳多樣性與種質鑒定、重要性狀相關基因的定位和分子標記輔助選擇等農作物育種領域發揮著重要作用[5-7]。SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)是特異性位點擴增片段測序技術的簡稱，該技術降低了基因組的復雜度，并且不依賴基因組序列，成為SNP標記開發的首選。相對于傳統的技術，SLAF-seq技術不僅節省測序成本和時間，而且在有參考基因組生物和無參考基因組生物中都可以廣泛應用[8-9]。

本研究擬通過簡化基因組技術SLAF-seq，對山西省30份地方梨品種資源進行高通量測序，鑒定SNP，并利用獲得的SNP數據進行群體多樣性分析，包括進化樹分析、群體結構分析及群體特異SNP標記的開發。這將為山西省地方梨種質資源的科學利用、品種選育、果樹生產及分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以山西省農業科學院果樹研究所梨資源圃搜集到的山西省各地區的30份地方梨品種為試材(表 1)。

1.2 基因組DNA 制備

2018年4月下旬，采集幼嫩的梨葉片做標記置于液氮中帶回室內，放至超低溫冰箱中，備用。采用CTAB法提取基因組 DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和ND-1000分光光度計檢測基因組 DNA的質量及濃度。按照高通量測序的要求，每樣品的DNA濃度達到30 ng·L-1，樣品純度OD260/280分布在1.8～2.0之間，電泳結果主帶清晰，無 降解。

1.3 酶切方案的設計和Illumina HiSeq測序

選取梨(Pyrus)基因組作為參考基因組進行酶切預測，梨基因組大小約為512 Mb，GC含量為37.29%(http://peargenome.njau.edu.cn/default.asp?d=4&m=2)。利用SLAF酶切預測軟件對參考基因組進行酶切預測，選擇最適的酶切方案。同時，選用日本晴水稻作為對照進行評估酶切方案的準確性。

根據選定的最適酶切方案，對檢測合格的各樣品基因組DNA分別進行酶切，對SLAF標簽(酶切片段長度為264～314 bp的序列)進行3′端加A處理、PCR擴增和切膠選取目的片段等過程，文庫質檢合格后用Illumina HiSeq XTen進行測序[10]。

1.4 群體遺傳分析

利用Dual-index對測序得到的原始數據進行識別，得到各個樣品的序列(reads)，過濾、接頭后對測序質量和數據量進行評估[11]。SLAF標簽的獲得和SNP標記的開發參照段義忠等[12]的方法。一般MAF>0.05的SNP在群體分析中被認為是有代表性的SNP。篩選出的有代表性的SNP通過Admixture[13]軟件分析群體結構，通過MEGA5[14]軟件結合neighbor-joining算法進行進化分析。

表1 山西省地方梨品種原始地理分布信息Table 1 Original geographic distribution of local pear germplasm in Shanxi

2 結果與分析

2.1 簡化基因組序列的產出和質量評估

對梨(Pyrus)參考基因組進行電子酶切預測，最終確定使用RsaⅠ+HaeⅢ酶切，預測到100 227個SLAF標簽，在基因組上基本分布均勻，酶切方案可行。試驗中，對照基因組(水稻)測序獲得0.22百萬序列(MReads)的數據量。從30個梨地方品種共獲得83.79 Mreads數據，測序平均Q30為96.33%，平均GC含量為38.90%(表2)。Q30數據表明測序質量高，測序結果 可靠。

表2 各樣品測序數據統計Table 2 Statistics for sequencing data

2.2 SNP 分子標記的鑒定

通過序列分析，從30個地方梨品種中共獲得603 177個 SLAF 標簽，并鑒定到多態SLAF標簽320 703個。通過分析多態SLAF標簽，鑒定到2 140 079 個 SNP標記，每個樣品的SNP數目從802 818至1 310 957不等，這些SNP的平均完整度為37.51%～61.26%。分析SNP 可以看到，不同樣品的 SNP 雜合率為10.98%～ 18.39%，它們之間存在一定差異，表明梨樣品基因組的雜合度很高(表3)。

2.3 群體遺傳分析

基于篩選出的有效 SNP，采用 Admixture 軟件計算了30個山西省地方梨品種的群體結構。從圖 1 可見，當K為 2 時，交叉驗證錯誤率最低，擁有最低交叉驗證錯誤率的分群數為最優分群數，所以，30個梨品種大致可以分為兩大類。‘小白梨’‘紅肖梨’‘海桃’‘碩豐梨’‘金梨’‘馬蹄黃’‘碭山黃’‘佛見喜’‘水紅肖’‘鐵梨’‘金梨變’‘笨梨’‘晉蜜梨’‘玉酥梨’‘晉早酥’‘玉露香梨’和‘甘子梨’來自于第一個原始祖先的可能性較大；‘香水梨’‘油梨’‘原平紅’‘肖梨’‘車頭梨’‘錘梨’‘晉酥梨’‘隰縣甜梨’‘酸圪盧’‘晉城夏’‘大黃梨’‘白肖梨’和‘兔頭紅’來自于第二個原始祖先的可能性較大。

表3 SNP統計Table 3 Statistics of identified SNPs

利用SNP標記信息，對30份地方梨品種進行聚類分析(圖 2)，在相似系數0.911處，所有梨種質聚為4個組。第一組包括3份種質，分別為‘小白梨’‘紅肖梨’和‘海桃’，前者為白梨，后兩者為秋子梨。第二組有1份種質‘碩豐梨’，原產地山西太谷。第三組包括12份種質，在相似系數0.946處，可以劃分為3個亞組，第1亞組包括1份種質‘金梨’；第2亞組包括‘馬蹄黃’和‘碭山黃’2份種質，起源地不確定；第3亞組包括9份種質，每個品種都有不同的分支，原產地各不同。第4組包括14份種質，在相似系數0.95處，可以劃分為2個亞組，第1亞組包括3份種質，‘晉蜜梨’‘玉酥梨’和‘晉早酥’的原產地在山西太谷；第2亞組包括11份種質，其中‘玉露香梨’ ‘晉酥梨’的原產地為山西太谷，‘車頭梨’‘錘梨’和‘甘子梨’的原產地為山西永濟，其他均在山西高平和晉城。另外，‘馬蹄黃’與‘碭山黃’在田間性狀上比較相似，在進化樹上顯示兩者親緣關系較近，推斷二者可能屬于同種不同名；‘金梨’與‘大黃梨’在田間性狀上比較相似，在進化樹上顯示兩者親緣關系較遠，可以斷定二者為不同梨品種。

圖1 K值對應的交叉驗證錯誤率Fig.1 Admixture validation error rate corresponding to K value

圖2 梨品種的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of pear varieties

3 討 論

3.1 簡化基因組技術在果樹分子標記開發上的可行性及優勢

目前，主要的簡化基因組測序技術有，基于限制性核酸內切酶的測序技術(RAD-seq)、基因分型測序技術(GBS)、基于IIB 型限制性核酸內切酶的測序技術(2b-RAD)和特異性長度擴增片段測序技術(SLAF-seq)[15-18]。這些技術只對酶切片段進行測序，可大幅降低基因組的復雜度，不受參考基因組的限制，操作簡便，可進行大規模SNP標記的開發和分析。本試驗運用 SLAF-seq 技術，在山西省30份地方梨品種中共獲得83.79 MReads，開發了603 177個SLAF 標簽，其中多態性 SLAF 標簽320 703個，從中鑒定到 2 140 079個SNP，利用有效的SNP標記分析了相應梨品種的群體結構和系統發生樹，為山西省地方梨品種的親緣關系提供依據。

3.2 山西省地方梨種質資源聚類及親緣關系 分析

遺傳多樣性評價對種質資源的保護和有效利用具有重要意義。在梨屬種質資源研究中，曲柏宏等[19]利用RAPD技術把40個梨品種和類型劃分為7類。趙國芳[20]利用ISSR分子標記技術對四大栽培系統具有典型代表性的25個栽培梨品種進行聚類,得出白梨系統與秋子梨系統親緣關系較近,其次與砂梨系統親緣關系較近，與西洋梨系統親緣關系較遠。岳曉燕等[21]選用17對SSR引物對福建的49個梨樣品的遺傳多樣性進行分析，基于Nei和Li的遺傳距離的鄰接法將所有地方品種劃分為9個組。Song等[22]利用134個SSR標記將99個梨品種的遺傳結構進行分析，結果表明日本梨與中國梨親緣關系密切。張小雙[23]將244份中國北方地方梨品種和野生資源聚類為4組，且聚類分析結果與地理位置相關。本試驗利用SNP標記把30份山西地方梨品種聚類為4大組，聚類分析結果與地理位置沒有明顯的關系，與Cao等[24]的研究結果不同。大多數地方梨品種聚到第4組，說明山西地區的梨種質親緣關系較近，地方梨品種的更進一步歸類應該結合果實性狀進一步研究。

3.3 山西省地方梨種質資源的鑒定與利用

山西省地方梨種質資源的遺傳多樣性豐富，在品種改良和選育的過程中，保證品種的真實性和純度不容忽視。生產上，一般采用形態性狀進行梨品種鑒定，鑒定周期長、準確性較低。梨為多年生木本植物，童期長，很多品種在苗期的形態差異較小，利用傳統的形態性狀等方法難以區分各個品種[25]。在本研究中，利用SNP標記可以快速客觀地鑒定出在田間性狀比較相似的品種，如‘金梨’與‘大黃梨’為不同梨品種，‘馬蹄黃’和‘碭山黃’可能屬于同種不同名，但仍需進一步試驗驗證。今后也可以利用親緣關系較遠的品種進行配置雜交組合。