小白菜小孢子發育與花器官形態相關性

楊延紅,姜倩倩,馬俊艷,宋桂全,牟建莉

(濰坊學院 生物與農業工程學院,山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東濰坊 261061)

小白菜(BrassicachinensisL.)為十字花科蕓薹屬2a生草本，是中國廣泛種植的重要葉用蔬菜作物，具有生長周期短、適應性強、易管理等特點，也是國內北方地區冬季的主要綠葉蔬菜[1]。小白菜屬于雜種優勢較明顯的異花授粉作物，利用常規育種方法得到純合親本的周期長，難度大。目前，使用游離小孢子及花藥培養的單倍體育種技術是縮短育種年限、提高育種效率的有效途徑。而能否從小孢子培養和花藥培養過程中獲得單倍體植株，取材的小孢子發育時期非常關鍵。許多研究發現，多數植物在游離小孢子培養中，處在單核靠邊期的小孢子更易誘導形成小孢子胚[2-4]。而小孢子發育時期與花蕾、花藥的外部形態密切相關[5-8]。為提高單倍體植株的誘導率，需選擇適宜的小孢子發育時期進行培養，但在培養過程中通過鏡檢確定每一個花藥中小孢子的發育時期，十分費時費力，增加污染幾率，影響小孢子活力；并且目前尚未有對小白菜小孢子發生和雄配子體發育的相關報道。為此，本研究通過觀察小白菜小孢子不同發育時期的花器官外部形態，根據花蕾大小及花藥顏色等判斷小孢子發育時期，為適宜小孢子培養材料的選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為不結球白菜 (BrassicachinensisL.)，又名小白菜，品種名上海青，花粉采集于濰坊學院設施蔬菜大棚，常規管理。在每天8:00左右采摘植株第二側枝同一部位的不同大小花蕾，一部分花蕾用卡諾固定液固定，供后期制片觀察，另一部分用于測量、觀察花器官的外部形態指標。

1.2 方 法

1.2.1 花蕾外部形態特征觀察 選取大小不同的小白菜花蕾(如圖1)，采用數顯游標卡尺測量小白菜的外部形態指標：花蕾縱橫徑、花萼和花瓣長，觀察花蕾的外部形態特征；之后將花藥剝離出來，測量花藥的長度和寬度，觀察花藥的形態特征。計算出瓣萼比、花藥長寬比和花蕾縱橫徑之比。對于每一個發育時期的花蕾觀察和測量其外部特征數據15個，重復3次。

1.2.2 小孢子各發育時期觀察 參考張恩慧等[8]的方法進行花蕾固定，采用壓碎法制片，即先用鑷子小心剝去花萼和花瓣，再用解剖針將花藥取出擠壓，用DAPI熒光染液染色、壓片，最后制成臨時裝片，靜置染色5～10 min，置于Olympus顯微鏡下觀察拍照，確定小孢子不同發育時期。

1.3 數據處理

采用Excel 2013對以上指標進行分析。

2 結果與分析

2.1 小白菜小孢子發生及雄配子體發育過程

對不同大小花蕾的花藥進行染色制片，觀察小孢子發生(小孢子母細胞時期、四分體時期)、雄配子體發育(單核早中期、單核靠邊期、2-胞花粉時期以及3-胞花粉時期)。

2.1.1 小孢子母細胞時期 小白菜花粉囊內次生造孢細胞間黏性較大，成片分布，隨后形成較分散的由胼胝質包裹著的小孢子母細胞，隨著發育，小孢子母細胞由不規則形狀(圖2-A)逐漸變為圓形(圖2-C)，并開始進行減數分裂1期，在熒光顯微鏡下發現小孢子母細胞有兩個明亮的核(圖2-B、2-D)，因此，小白菜減數分裂中胞質分裂屬于同時型，即第1次分裂后不形成細胞壁，第2次分裂后形成細胞壁。

A、B.不規則小孢子母細胞，C、D.兩個近圓形的小孢子母細胞

2.1.2 四分體時期 小孢子母細胞減數分裂1期后胞質不分離，經過短暫的分裂間期后，兩個核進入減數分裂2期，最終胞質同時分離，形成由共同的胼胝質包被的四分體，各個小孢子之間也有胼胝質分割(圖3)，在顯微鏡下可觀察到4個明亮的細胞核及外面透明的胼胝質。小白菜四分體大多為四面體型(圖3-D、3-E)少數為十字交叉型(圖3-A、3-B、3-C)，還有一少部分呈現不規則的立體效果，介于二者之間(圖3-F、3-G)。

2.1.3 單核早中期 隨著小孢子的進一步發育，包裹在四分體外面的胼胝質被酶解，釋放出4個小孢子。剛釋放的小孢子細胞壁較薄，還未形成花粉壁(圖4-A)，液泡不明顯，DAPI染色可見細胞核居于細胞中央(圖4-B)；隨后小孢子體積逐漸增大，花粉壁同步加厚，體積增加1～2倍時，細胞核依然位于中央，以上階段為單核早中期小孢子(圖4-C、4-D)。

2.1.4 單核靠邊期 隨著小孢子體積增大，花粉內小液泡不斷增多，并逐漸融合成大液泡，將細胞核擠壓到細胞邊緣位置，花粉外壁沉積物質更多，細胞壁變得很厚(圖5-A、5-B)，同時單核靠邊期花粉開始出現3條明顯的萌發溝，花粉此時呈三裂瓣狀(圖5-C、5-D)。

2.1.5 2-細胞和3-細胞花粉期 小孢子細胞核分裂后，形成營養細胞核和生殖細胞核，兩個細胞核差異明顯，其中，營養細胞核體積較大，而生殖細胞體積較小并靠近細胞壁(圖6-A、6-B)。最終形成1個大的營養細胞包裹著1個小的生殖細胞，即2-細胞花粉。

隨后生殖核經過一次均等的有絲分裂，產生兩個子核，發育成兩個外形相同的精細胞，在熒光顯微鏡下兩個精細胞核非常明亮，而營養細胞核亮度相對較低(圖6-C、6-D)，此時小孢子發育為成熟花粉粒，因此，小白菜花粉為3-胞花粉。

A-C.四分體(十字交叉型)；D、E.四分體(四面體型)；F、G.四分體(介于四面體型和十字交叉型之間)

A、B.剛從四分體釋放的單核早期小孢子；C、D.形成花粉壁的單核中期小孢子

A、B.單核靠邊期小孢子；C、D.出現萌發溝的單核靠邊期小孢子

A、B.2-胞花粉；C、D.3-胞花粉；a.生殖細胞；b、c.營養細胞核；d.兩個精細胞

2.2 小白菜小孢子發育時期與花蕾形態特征相關性

小白菜小孢子發育時期與花蕾縱徑、花蕾橫徑以及花萼長、花瓣長等特征密切相關。從表1可以看出，花蕾縱橫徑、花萼長、花瓣長均隨著小孢子發育顯著增長。小孢子花蕾縱徑為 0.85～1.32 mm，橫徑為0.84～1.20 mm，為四分體時期；花蕾縱徑為 1.64～2.22 mm，橫徑為1.31～1.68 mm，為單核早中期；花蕾縱徑為2.68～ 3.80 mm，橫徑為1.91～2.19 mm，為單核靠邊期；花蕾縱徑為4.02～4.82 mm，橫徑為2.27～ 2.40 mm，為2-胞花粉時期；小孢子花蕾縱徑為4.99～7.00 mm，橫徑為2.48～3.08 mm，為成熟3-胞花粉。

表2表明，在小孢子發育過程中，肉眼可觀察到，隨著花蕾膨大，在單核靠邊期時萼片由淺綠色變為綠色；四分體時期萼片緊包裹花冠；單核早中期萼片稍展開，花瓣微露出；單核靠邊期萼片頂端展開較大，花瓣長于萼片；2-胞花粉時期花蕾較大，花冠稍微展開；3-胞花粉時期花冠完全打開。

表1 小白菜小孢子各發育時期花蕾形態特征Table 1 Bud morphological characteristics of microspore development of Brassica chinensis L. at various stages

表2 小白菜小孢子各發育時期的花蕾外部形狀特征Table 2 Bud external morphology characteristics of microspore development of Brassica chinensis L. at various stage

2.3 小白菜小孢子發育時期與花藥形態特征相關性

表3表明，小白菜的花藥長、寬、和小孢子發育時期密切相關，其中四分體時期花藥縱徑 0.59～0.90 mm，花藥橫徑0.17～0.41 mm，花藥顏色為淺綠色(圖7-A)；單核早中期花藥縱徑 1.06～1.73 mm，花藥橫徑0.41～0.60 mm，花藥顏色為淺綠色(圖7-B)；單核靠邊期花藥縱徑 1.76～2.39 mm，花藥橫徑0.64～0.82 mm，花藥顏色為淺黃綠色(圖7 -C)；2-胞花粉時期花藥縱徑2.35～2.61 mm，花藥橫徑0.83～0.90 mm，花藥顏色為淺黃色(圖7-D)；3-胞花粉時期花藥縱徑2.63～2.66 mm，花藥橫徑0.96～1.06 mm，花藥顏色為淺黃色(圖7-E)。

表3 小白菜小孢子不同發育時期花藥大小特征Table 3 Anther size characteristics of microspore development of Brassica chinensis L. at various stage

A.四分體時期；B.單核早中期；C.單核靠邊期；D.2-胞花粉；E.3-胞花粉

3 結論與討論

3.1 小白菜小孢子各發育階段細胞學特征

多數植物成熟花粉屬于二胞花粉[9]，如甜瓜、辣椒等成熟花粉含有一個生殖細胞和一個營養細胞[10-11]，少數植物花粉成熟時含有一個營養細胞和兩個精細胞，如白芷和青花菜[12-13]。本試驗對不同發育時期小白菜小孢子進行DAPI熒光染色制片，詳細觀察小孢子各發育時期的細胞學形態特征，其中小孢子發生過程中，胞質分裂為同時型，四分體大多為四面體型(圖3-C)，少數為十字交叉型(圖3-E)，有極個別四分體處于兩者之間(圖3-G)。雄配子體發育過程中，觀察到單核花粉早中期、靠邊期、2-胞花粉時期，最終生殖細胞分裂形成3-胞花粉(圖6-C、6-D)，這與十字花科其他蔬菜研究結果一致[13-14]。

觀察小白菜小孢子發育過程中，在單核發育期之前的小白菜花蕾非常小，因此筆者將花蕾直接置于FAA固定液中進行固定，制片時采取固定材料和活體材料同時壓片DAPI染色，結果表明都可較好染上細胞核，所以在實際操作中，可不用固定材料，直接將花藥置于10%的蔗糖溶液中擠壓出小孢子，壓片染色。

3.2 小白菜小孢子發育過程與花器官相關性

目前，花藥和小孢子培養技術已取得了較大進展，但是在具體的實踐操作當中，特定植物小孢子培養體系的建立受多種因素的影響，其中適宜小孢子發育時期的選擇是關鍵[15]。發育時期過早，很難產生胚狀體；發育時期過晚，成熟花粉含有的激素水平不平衡，導致脫分化能力較差，也不能誘導成胚。所以確定小孢子發育時期相對應的花器官外部形態指標至關重要，可提高小孢子培養的效率和成功率。已有研究表明，十字花科植物如甘藍[16]、花椰菜[17]、芥菜[18]、蕪菁[19]的單核靠邊期是進行小孢子培養的最佳時期。通過小白菜花蕾縱橫徑、花瓣長、花萼長等特征測量觀察和花藥形態的觀察，發現單核靠邊期的小孢子，外部花蕾飽滿呈綠色，花萼包被著花冠，花藥為淺黃綠色，花蕾縱徑為2.68～3.80 mm，花蕾橫徑為 1.91～2.19 mm，縱橫徑比為1.40～1.74，花瓣長為2.70～3.22 mm，花萼長為2.15～2.71 mm，瓣萼比為1.19～2.26，花藥縱徑長為 1.76～2.39 mm，花藥橫徑為0.64～0.82 mm，花藥長寬比為2.75～2.91，此時大多數小孢子處于單核靠邊期。同時筆者在試驗中發現，處于單核靠邊期的小孢子花粉處于圓形和三裂形之間，這和張恩慧等[8]在甘藍小孢子中的發現一致，說明同一屬植物花粉發育過程較接近。因此，在小白菜小孢子培養中，可綜合花蕾、花藥的形態、大小和顏色等外觀指標來判斷小孢子發育時期，無需鏡檢、準確取材培養，有利于提高小孢子培養效率。