循環腫瘤細胞聯合癌胚抗原檢測在非小細胞肺癌中的臨床價值*

肖牘清，吳兆紅，譚博，王戈菲

(廣州醫科大學附屬第三醫院 心胸外科，廣東 廣州 510000)

肺癌是所有惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80%～85%，由于缺乏特異性標志物，70%NSCLC診斷時處于晚期，5年生存率不足15%[1-3]。在NSCLC中，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和細胞角蛋白19片段(cytokeratin-19 fragments,CYFRA21-1 )是最敏感的腫瘤標志物[4-5]。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)來源于原發腫瘤，可評估腫瘤的發生發展狀態，是目前最具潛力的腫瘤標志物之一[6-8]。CTC與CEA均在NSCLC的診斷、分期、治療及預后方面有一定的作用，但由于其敏感性及特異性的問題，二者在臨床中的應用都有一定的局限性[9-10]。研究表明，CYFRA21-1、鱗狀上皮細胞抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCC-Ag)及CEA等傳統腫瘤標志物和“液體活檢”[如CTC、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)等]是NSCLC診斷及監測的重要指標[11-12]。目前，傳統腫瘤標志物的聯合檢測在臨床中已有較廣泛的應用[13]，然而它們與CTC、ctDNA等聯合檢測的臨床應用尚無進一步的研究論證，因此本研究旨在探討NSCLC患者外周血傳統腫瘤標志物CEA和液體活檢CTC聯合檢測的水平變化及臨床意義，現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象、主要試劑與儀器

1.1.1研究對象 選取2015年1月—2018年12月病理確診NSCLC患者54例作為研究組，男43例、女11例，平均(63.4±1.58)歲，腫瘤分期依據國際抗癌協會(union for international cancer control，UICC)提出的臨床分期標準[14]Ⅰ～Ⅱ期19例、Ⅲ期14例及Ⅳ期21例，肺腺癌37例、肺鱗癌17例；選取肺部良性疾病患者21例作為對照組，男13例、女8例，平均(62.7±2.16)歲，肺炎18例和肺結核3例。本研究納入標準：(1)研究組患者經病理首次確診且未行放化療，(2)對照組患者經影像學檢查或病理排除惡性病變，(3)所有患者及家屬同意并自愿參加本研究。排除標準：(1)患者診斷尚不明確，(2)患者既往有放化療病史，(3)患者有其他系統腫瘤或肝腎功能不全，(4)患者無法配合采集標本和資料。2組患者年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究通過醫院倫理委員會的審批(2017069)。

1.1.2主要試劑與儀器 人體外周血白細胞去除試劑盒[含磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液、鼠抗人上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)抗體，批號HCDUB51001]和免疫熒光光原位雜交樣品處理試劑盒(含CD45抗體及染色體探針，批號IHIUB51001)購自江蘇萊爾生物醫藥；全自動電化學免疫發光儀與配套CEA檢測試劑盒(批號20190917)購自鄭州安圖生物醫藥。

1.2 方法

1.2.1免疫磁珠法檢測CTC 采用免疫磁珠法[15]分離富集CTC。采集2組患者清晨空腹肘正中靜脈血5 mL，靜置48 h內離心5 min，棄上清，加裂解液，混勻細胞，離心，棄上清，再次加入裂解液，重復混勻、離心后去上清；PBS洗滌免疫磁珠微粒，按每人份鼠抗人EPCAM抗體200 μL及10 μL加入前期處理好的樣本中，充分混勻、孵化30 min，再次沖洗、離心5 min，棄上清，加PBS至500 μL與抗體標記的磁珠20 μL反應20 min。免疫熒光原位雜交(immune fluorescence in situ hybridization，imFISH)檢測分析富集后細胞，CD45抗體進行細胞免疫熒光檢測，用8號著絲粒探針進行熒光原位雜交；在熒光顯微鏡下通過雙免疫標記對富集細胞做形態學分析。將8號染色體異常擴增信號點>2個、CD45陰性的細胞定義為腫瘤細胞；CTC數量≥2個的研究對象定義為CTC陽性[16]。

1.2.2酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測CEA 采集2組患者清晨空腹血液標本3 mL，ELISA法檢測血清CEA水平[17]，采用全自動電化學免疫發光儀及原裝配套使用試劑盒，嚴格按照說明書檢測患者血清中CEA濃度，血清CEA水平≥5 μg/L定義為CEA陽性[18]。

1.2.3聯合檢測 CTC與CEA聯合檢測為并聯檢測，即有一項檢測指標陽性為聯合檢測陽性[19-20]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CTC和CEA單獨檢測

研究組患者外周血CTC和CEA的陽性率高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者CTC和CEA的陽性率比較[n(%)]Tab.1 Comparison of the positive rates of CTC and CEA between two groups[n(%)]

2.2 ROC曲線結果

研究組患者ROC曲線結果顯示，CTCAUC為0.828，95%可信區間(confidence interval，CI)為0.723～0.905；CEAAUC為0.738，95%CI為0.622～0.831，CTC與CEA聯合檢測AUC為0.737，95%CI為0.622～0.832。見圖1。

圖1 研究組CTC、CEA及聯合檢測的ROC曲線結果Fig.1 ROC curves of CTC, CEA and combined detection in the research group

2.3 CTC聯合CEA檢測

研究組患者外周血CTC聯合CEA檢測的陽性率高于對照組，差異有統計學意義(χ2=6.83，P<0.05)；研究組Ⅲ～Ⅳ期患者外周血CTC聯合CEA檢測的陽性率高于研究組Ⅰ～Ⅱ期，差異有統計學意義(χ2=5.214，P<0.05)；研究組Ⅲ～Ⅳ期患者外周血CTC聯合CEA檢測的陽性率高于對照組，差異有統計學意義(χ2=21.460，P<0.05)。見表2。

表2 CTC與CEA聯合檢測[n(%)]Tab.2 Combined detection of CTC and CEA [n(%)]

2.4 CTC聯合CEA檢測和單一檢測的比較

研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC+CEA聯合檢測陽性率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC、CEA單獨檢測陽性率與對照組的差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

CTC由Ashworth于1869年首次提出，CTC與NSCLC的診斷、遠處轉移及預后具有相關性[21-22]。

表3 CTC與CEA聯合檢測和單一檢測的比較[n(%)]Tab.3 Comparison of CTC and CEA combined detection and single detection[n(%)]

CEA為目前為NSCLC中應用最為廣泛的腫瘤標志物之一，連續監測CEA有助于NSCLC的診斷，評估預后和療效[23]。本研究結果顯示，研究組患者外周血CTC和CEA單獨檢測陽性率高于對照組(P<0.05)，CEA和CTC單獨檢測可以輔助診斷NSCLC。有研究表明，二者單獨檢測在臨床中的應用有一定的局限性，CTC檢測不僅花費昂貴，而且敏感性較低，CTC在NSCLC中的應用有局限，但在腫瘤生物標志物中，CTC與CEA具有相關性[24]。

沈茜等[25]的研究結果顯示，將CTC≥2個/mL外周血或血清癌胚抗原(CEA)水平≥5 μg/L作為NSCLC診斷指標時，敏感度為87.5%(119/136)，特異度為85.9%(128/149)，提示CTC和CEA在NSCLC的診斷中具有重要價值。Zhou等[26]研究也認為CTC與CEA聯合檢測是在NSCLC中較好的一個預測模型。但目前研究僅分析CTC或CEA單獨檢測的價值，以及CTC與CEA的相關性，尚未見臨床研究探討聯合檢測在NSCLC的臨床價值。本研究ROC曲線結果顯示，研究組患者CTC與CEA聯合檢測AUC為0.737(95%CI為0.622～0.832)，且CTC聯合CEA檢測的陽性率高于對照組(P<0.05)，因此CEA和CTC聯合檢測也可輔助診斷NSCLC。此外，研究組Ⅲ～Ⅳ期患者聯合檢測的陽性率分別高于對照組和研究組Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，因此提示CTC與CEA聯合檢測與NSCLC分期密切相關，晚期NSCLC(Ⅲ～Ⅳ期)患者聯合檢測的陽性率高于早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)患者，臨床中可通過聯合檢測CTC與CEA初步判斷患者分期，評估患者預后，指導治療，提高患者生存質量。另外，研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC+CEA聯合檢測陽性率高于對照組(P<0.05)，而研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC、CEA單獨檢測陽性率與對照組的差異無統計學意義(P>0.05)。因此，早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)患者與對照組患者外周血CTC、CEA單獨檢測的陽性率無差異，CTC、CEA單獨檢測不能輔助檢測早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)，而早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)患者外周血CTC與CEA聯合檢測陽性率高于對照組，CTC與CEA聯合檢測較單一檢測在臨床應用中更具有優勢，可以輔助診斷早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)，為NSCLC患者早期治療提供依據，改善NSCLC患者的遠期預后。

在臨床中，因受客觀因素的限制，部分病人無法利用金標準來診斷，若僅依靠臨床表現及單項指標來診斷，則診斷的準確性較低，而通過幾種指標聯合檢測可提高診斷的準確性[27-28]。CTC、CEA單獨檢測在NSCLC中的臨床研究較為常見[29-30]，而CTC與CEA聯合檢測在NSCLC中的臨床價值研究較少。Ding等[31]通過回歸分析證實CTC、CEA均為肺腺癌的獨立危險因素，檢測CTC和CEA水平可作為提高肺腺癌診斷率的一種方法。本研究論證了CTC與CEA聯合檢測在NSCLC早期診斷中的臨床意義，二者聯合檢測不僅提高了CTC在NSCLC中的應用價值，也為NSCLC高危患者的篩查提供了一種無創、簡捷的方法。本研究結果顯示，研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC、CEA單獨檢測陽性率與對照組無差異(P>0.05)，研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血聯合檢測的陽性率高于對照組(P<0.05)，提示CTC和CEA聯合檢測在早期NSCLC的診斷中更具有優勢。在臨床中，依靠腫瘤標記物單一檢測診斷早期(Ⅰ～Ⅱ期)NSCLC較困難，通過CTC和CEA聯合檢測可以輔助診斷早期(Ⅰ～Ⅱ期)NSCLC，必要時可聯合影像學結果共同判斷，可早期發現NSCLC，早期進行干預，對提高NSCLC患者遠期生存質量有重要意義。

本研究存在以下不足，本研究為單中心研究，數據的選擇存在一定的偏差；作為回顧性分析，部分患者缺失隨訪資料，未能進一步做預后生存分析；僅初步探討CTC與CEA聯合檢測在NSCLC患者中的臨床價值，CTC與CEA、CYFRA21-1及NSE等多種傳統腫瘤標志物聯合檢測在肺癌早期診斷和推測預后的意義則有待進一步論證。

總之，CTC、CEA單獨檢測及CTC聯合CEA檢測均可輔助診斷NSCLC，CTC聯合CEA檢測與NSCLC的分期有關，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)NSCLC患者CTC+CEA聯合檢測較高，CTC聯合CEA檢測較單一檢測更有助于輔助診斷早期(Ⅰ～Ⅱ期)NSCLC。對于NSCLC高危患者，應聯合CTC與CEA水平進行評估，早期診斷，明確分期，及早干預，更有利改善患者預后，延長生存期。