綿羊背最長肌組織中TMOD4基因表達差異研究

張鑫 孫洪新 劉月

摘要：研究旨在比較分析不同發育階段綿羊背最長肌中TMOD4基因的表達水平。采用qRT-PCR和Western-Blot技術檢測綿羊1、7、13 月齡3個階段背最長肌中TMOD4基因mRNA和蛋白質的相對表達量。結果表明，TMOD4的mRNA在1月齡綿羊背最長肌組織中表達量最高，13月齡次之，7月齡較低于13月齡，其中1月齡與7月齡、13月齡之間差異極顯著（P<0.01），7月齡與13月齡之間差異顯著（P<0.05）。TMOD4蛋白水平在1月齡中最高，7月齡次之，13月齡中最低，1月齡與7月齡和13月齡之間差異極顯著（P<0.01），7月齡與13月齡之間差異顯著（P<0.05）。結果表明，TMOD4基因與綿羊背最長肌組織發育相關。

關鍵詞：綿羊;TMOD4基因;背最長肌;表達水平

原肌球調節蛋白4（tropomodulin4，TMOD4）基因編碼修飾蛋白——TMOD4蛋白在骨骼肌細胞中與肌動蛋白慢速生長末端結合，阻止其延展或聚合，維持肌動蛋白絲的穩定，在原肌球蛋白與肌動蛋白的相互作用中發揮了重要作用[1]。

TMOD基因家族共有4個亞型，分別是TMOD1、TMOD2、TMOD3和TMOD4[2]。TMOD1主要表達于終分化細胞[3]，TMOD2主要在神經元表達[4]，TMOD3普遍表達[5]，TMOD4在骨骼肌和心臟中高度表達[6]。已有研究表明，TMOD4與TMOD1高度相同，功能相似。TMOD1的過度表達會導致心肌細胞的收縮功能減弱，小鼠上TMOD1的超表達或抑制表達會造成心肌功能異常，轉基因小鼠試驗發現超表達TMOD1會造成小鼠胚胎的發育異常[7]。有研究顯示，在成纖維細胞和成肌細胞中的TMOD1通過減少肌特異性基因的表達而抑制了肌源性分化[8]，表明TMOD1可能在肌源性細胞的分化中起到抑制作用。TMOD4和TMOD1的序列相似并且蛋白功能可相互替換[9]，并且TMOD1大量存在于有纖維分裂后的終末分化細胞中，包括橫紋肌、紅細胞、晶狀體纖維細胞和神經元[4]。

TMOD4是哺乳動物骨骼肌中主要的TMOD亞型，在心肌中的作用與TMOD1相當[10-11]。在非洲爪蟾早期肌纖維細胞中TMOD4基因與肌纖維細胞早期分化高度相關[12]，已有研究證明豬背最長肌中TMOD4參與調控脂肪沉積與肌纖維發育[13-14]。TMOD4基因共有9個外顯子和8個內含子，其啟動子上游序列有2個結合位點：MEF2A和C/EBPδ，而這2個位點的靶基因分別與肌纖維生長和脂肪分子生成有關，當TMOD4高表達時，促進脂肪沉積，抑制肌纖維發育;低表達時，抑制脂肪生成，促進肌纖維生長[14]。以上研究說明，TMOD4與肉質高度相關，但目前沒有任何關于綿羊的TMOD4基因的表達研究，本研究比較不同月齡綿羊背最長肌組織中TMOD4的mRNA和蛋白水平，目的是為TMOD4表達水平與綿羊肌肉發育相關性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來自河北連生農業開發有限公司種羊場，所選試驗動物為寒泊羊一代，相同月齡綿羊在相同的飼養管理條件下飼養，滿足正常的生長營養需求。選擇1月齡、7月齡的公綿羊各3只，13月齡公綿羊2只，于目標日齡當天屠宰，采集8個樣品的背最長肌組織，置于液氮中速凍，之后存放于-80 ℃中保存備用。

1.2 主要試劑及儀器

5X All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）試劑盒（G492，100×20 μL）;EvaGreen 2× qPCR MasterMix-no DYE 熒光定量試劑盒（MasterMix-S，4×1.25 mL）;兔抗人TMOD4多克隆抗體，Affinity Biosciences常州市祥泰生物科技有限公司;鼠抗人GAPDH單克隆抗體;Western試劑盒（內含山羊抗兔及山羊抗鼠IgG）;ND-1000核酸蛋白測定儀;組織蛋白裂解液和 PMSF;BCA蛋白定量試劑盒;微量移液器（Eppendorf，德國）;凝膠成像系統（MiniBis，以色列）;PCR 擴增儀（Bio-Rad，美國）;實時熒光定量PCR儀（羅氏-96，瑞士）;電泳儀（六一生物，中國）;酶標儀（RT-6000 型號）;Western 全自動蛋白分析系統。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 本試驗采用Trizol試劑盒說明書提取綿羊背最長肌的總RNA，DEPC水溶解，電泳檢測RNA完整性，測定總RNA的濃度和純度，調整濃度至500 ng/μL，-80 ℃保存。

1.3.2 引物設計與合成 通過參考文獻和查詢NCBI數據庫選取TMOD4基因的引物序列，內參基因選用GAPDH。所有引物由生工生物工程股份有限公司石家莊分部合成，引物序列見表1。

1.3.3 cDNA合成 總RNA反轉錄采用5X All-In-One RT Master Mix試劑盒操作說明進行反轉錄。在200 μL離心管中配制反應液，總體積為 20 μL。反轉錄體系及條件：RNA Template 2 μg，AccuRT Reaction Mix（4） 2 μL，加無酶水補足至 8 μL。置于PCR儀中42 ℃孵育2 min或室溫孵育5 min，取出后置于冰上冷卻，加入AccRT Reaction Stopper（5×） 2 μL，5×All-ln-One RT Master Mix 4 μL，無酶水 6 μL，總體積為20 μL。將PCR管短暫離心混勻置于PCR儀中，反應程序為25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。反應完成后取出cDNA產物置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.4 實時熒光定量PCR 試驗全程冰上進行，每個樣品設置3個重復。按照Eva Green 2×q PCR Master Mix-no DYE熒光定量試劑盒說明書進行操作（表2、表3），采用羅氏-96熒光定量PCR儀對不同月齡綿羊背最長肌組織內TMOD4基因的相對表達量進行分析，觀察擴增的熔解曲線。采用 Excel 軟件處理實時熒光定量PCR結果，按照2-ΔΔCT相對定量計算公式，分析綿羊不同月齡背最長肌組織中TMOD4基因 mRNA 的相對表達量。

1.3.5 Western-Blot 采用RIPA蛋白裂解液（強）提取背最長肌組織總蛋白，樣品質量與裂解液量的比例為1 g ∶ 10 mL，BCA法測定蛋白濃度。樣品的制備方法與傳統Western Blot相同，根據Western全自動蛋白表達分析系統說明書進行后續操作。結束后用Western全自動蛋白表達分析軟件進行灰度值分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取和qRT-PCR

測定的RNA濃度在1 000 ng/μL左右，D260 nm/D280 nm比值為1.9～2.0。采用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA條帶清晰（圖略），28S rRNA和18S rRNA比值接近2 ∶ 1，表明所提取的總RNA質量較好，可用于后續試驗。

由圖1可知，根據最佳反應體系和反應條件建立內參基因GAPDH和目的基因TMOD4的標準曲線，回歸系數（r2）分別為0.993和0.991，斜率分別為-3.231和-3.228，目的基因與內參基因差值均<0.1，說明CT值和模板起始濃度對數值之間具有良好的線性關系，內參基因和目標基因有很高的擴增效率。擴增曲線符合標準的“S”形曲線，目的基因和內參基因的熔解曲線均呈單峰，無非特異性擴增及引物二聚體。

2.2 不同月齡公綿羊背最長肌TMOD4基因mRNA的相對表達量

圖2表明，不同月齡對TMOD4基因mRNA相對表達量有極顯著影響（P<0.01）。在1月齡表達量最高且極顯著高于13月齡和7月齡（P<0.01），13月齡和7月齡之間差異顯著（P<0.05）。

2.3 不同月齡綿羊背最長肌TMOD4蛋白相對表達量

采用Western全自動蛋白表達分析系統的Western-blot技術檢測不同月齡綿羊背最長肌組織TMOD4蛋白表達量，目的蛋白TMOD4和內參蛋白GAPDH條帶清晰，不同月齡間內參蛋白條帶面積和灰度基本一致，符合內參蛋白恒定表達的特性。蛋白條帶面積和灰度值大小采用Western全自動蛋白表達分析系統自帶的分析軟件進行分析計算，TMOD4與內參對比，進行半定量分析。由圖3和圖4可知，月齡的差異對TMOD4蛋白相對表達量有極顯著影響（P<0.01）。綿羊在1月齡時，TMOD4蛋白的相對表達量最高，平均值為2.05;13月齡時表達量最低，平均值為0.34。隨月齡的增加，綿羊背最長肌TMOD4蛋白相對表達量呈下降的趨勢，1月齡最高，與7月齡、13月齡表達量差異極顯著（P<0.01）;7月齡次之，與13月齡差異顯著（P<0.05）;13月齡最低。

3 討論

TMOD4是哺乳動物骨骼肌中主要的TMOD亞型，在心肌中的作用與TMOD1相當。TMOD4基因共有9個外顯子和8個內含子，其啟動子上游序列有2個結合位點：MEF2A和C/EBPδ，而這2個基因分別與肌纖維生長和脂肪分子生成有關，當TMOD4高表達時，促進脂肪沉積，抑制肌纖維發育;低表達時，抑制脂肪生成，促進肌纖維生長[14]。本研究中，綿羊在1月齡時，TMOD4 mRNA表達水平最高，其次是13月齡，最低是7月齡，TMOD4 mRNA水平隨月齡增加大幅下降最后趨于平緩略微上升;綿羊在1月齡時TMOD4蛋白水平最高，在7月齡時次之，13月齡最低，TMOD4蛋白水平隨月齡增加呈大幅下降趨勢且后期趨于平緩。試驗所選綿羊為寒泊羊，具有較高的產肉能力，而TMOD4作為參與決定肉質的重要基因之一，表達量趨勢可以解讀為在綿羊發育早期主要是脂肪沉積抑制肌纖維發育，而中后期則主要促進骨骼肌的發育并且抑制脂肪生成。喬永等研究湖羊不同月齡脂肪沉積發現，在綿羊早期脂肪沉積最快[15]，本研究結果與之相似。

Nworu等對非洲爪蟾胚胎細胞進行原位雜交試驗發現，TMOD4基因在骨骼肌組織早期肌原纖維至關重要，控制骨骼肌發育[16]。TMOD4在終末分化細胞中也大量存在，在橫紋肌中，TMOD4與原肌球蛋白協同作用，結合并限制肌動蛋白細纖維尖端肌動蛋白單體交換，在骨骼肌快速收縮中占主導地位。本研究中TMOD4在早期綿羊背最長肌組織中表達量最高，為肌纖維發育和骨骼肌的生長做準備，并且羔羊活潑好動，骨骼肌收縮迅速，所以此階段綿羊TMOD4表達量最高。隨著月齡增加，綿羊骨骼肌發育完全，肌纖維粗壯，肌間脂肪減少，活動減少，TMOD4表達水平降低。

本研究初步探討了TMOD4在綿羊不同月齡間的表達差異和大體趨勢，相關TMOD4對肉質品質的影響還有待于進一步研究。

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