分散固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定茶葉中的28種農(nóng)藥殘留

趙麗 農(nóng)蕊瑜 師真

摘要：建立測定茶葉中28種農(nóng)藥殘留量的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。茶葉樣品經(jīng)乙腈和正己烷提取后，采用分散固相萃取方法作前處理，以N-丙基乙二胺（PSA）、Bulk Carbograph、C18EC、MgSO4吸附并凈化提取液中的干擾組分，凈化液經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜測定，以基質(zhì)內(nèi)標法定量。采用本試驗建立的方法，在0.002～1.000 μg/mL 范圍內(nèi)，28種農(nóng)藥的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r>0.995，方法檢出限為0.10～5.0 μg /kg，定量限為 0.30～15.00 μg /kg。0.075、0.375、0.750 mg/kg這3個添加量的平均加標回收率為63.9%～102.9%，相對標準偏差為2.05%～7.02%。與傳統(tǒng)的QuEChERS法相比，該方法具有操作簡單、快速，試劑用量少，回收率高，準確性強等特點。

關(guān)鍵詞：茶葉;氣相色譜-質(zhì)譜法;農(nóng)藥殘留;分散固相萃取

茶葉是我國的重要經(jīng)濟作物，也是出口貿(mào)易的重要組成部分。但茶葉在生長過程中易受到假眼小綠葉蟬、茶刺蛾、茶橙癭螨等病蟲害的污染，茶園雜草也會吸收肥料和水分，影響茶樹的正常生長，為防治病蟲害和排除雜草干擾，最常用的方法就是噴灑農(nóng)藥。而農(nóng)藥的過度使用已經(jīng)影響到茶葉的品質(zhì)和安全問題，農(nóng)藥殘留超標已成為制約茶葉對外貿(mào)易的重要影響因素之一[1]。我國2017年6月18日起實施的GB 2763—2016《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中對茶葉中48種農(nóng)藥殘留制定了限量要求，相比GB 2763—2014版增加了20種。因此，建立一種快速、準確度、高效的茶葉中農(nóng)藥殘留檢測方法尤為重要。為提高檢測的準確度，有效可行的樣品前處理方法尤為重要。

目前，國內(nèi)外對于茶葉中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法主要有固相萃取（SPE）法[2-3]、QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）法[4-6]、基質(zhì)固相分散萃取法[7-9]等。檢測方法主要有氣相色譜法[10-11]、氣相色譜-串連質(zhì)譜（GC-MS/MS）法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）[13]法。本研究在現(xiàn)有文獻的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化前處理方法，全部前處理過程不須要進行溶劑換相和濃縮操作，以期為茶葉中多種農(nóng)藥殘留的快速定量檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試茶葉為市購食品安全風險監(jiān)測樣品。

試劑：敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、滅線磷、樂果、甲基對硫磷、甲草胺、甲霜靈、毒死蜱、粉銹寧、除草醚、異菌脲、聯(lián)苯菊酯、三氟氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、乙拌磷、艾氏劑、反-氯丹、α-硫丹、順-氯丹、狄氏劑、β-硫丹、氯菊酯、阿特拉津（100 μg/mL）等，均購自中國計量科學研究院;乙腈、正己烷（色譜純），購自美國賽默飛世爾公司;SPE N-丙基乙二胺（PSA） Packing（7.5 mg Bulk Carbograph，50.0 mg PSA，50.0 mg C18EC，150.0 mg MgSO4）凈化劑（61.8 μmol/L），購自美國安捷倫公司;PSA凈化劑（10～20 nmol/L）、石墨化炭黑（GCB）凈化劑（120～400目）、MgSO4凈化劑（50 μmol/L），均購自天津博納艾杰爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，電子天平（感量0.01 g），均質(zhì)機，GM2000 Retsch渦旋機。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制 空白基質(zhì)溶液：稱取空白茶葉樣品10.0 g，經(jīng)提取、凈化后，凈化液置于4 ℃冰箱保存。

標準儲備液：將1.00 mL 100 μg/mL的各試劑標準溶液轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，用正己烷定容，配制成質(zhì)量濃度均為2.00 μg/mL的標準儲備液，置于 4 ℃ 冰箱保存。

基質(zhì)標準儲備液：將0.10 mL 100 μg/mL的各試劑標準溶液轉(zhuǎn)移到10 mL的容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液定容，配制成質(zhì)量濃度均為1.00 μg/mL的基質(zhì)標準儲備液，置于4 ℃冰箱保存。

標準工作液：使用標準儲備液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000 μg/mL的系列標準工作液，待 GC-MS/MS檢測。

基質(zhì)標準工作液：使用基質(zhì)標準儲備液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.002、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000 μg/mL的系列基質(zhì)標準工作液，待GC-MS/MS檢測。

內(nèi)標工作液：將1.0 mL 100 μg/mL的阿特拉津內(nèi)標溶液轉(zhuǎn)移到5.0 mL的容量瓶中，用正己烷定容，配制成質(zhì)量濃度均為20.0 μg/mL的內(nèi)標工作液。

1.3.2 樣品的制備 提取：稱取混勻后的茶葉樣品300 g，經(jīng)均質(zhì)機粉碎，裝袋避光冷凍保存，備用。稱取上述茶葉粉末2.00 g于10 mL離心管中，加入 60 μL 濃度為20.0 μg/mL的內(nèi)標工作液、2.0 mL純水、2.0 mL乙腈、3.0 mL正己烷充分混勻，渦旋振蕩1 min，浸提10 min，再次渦旋振蕩5 min，2 000 r/min 離心5 min，收集上清液，待凈化。

凈化：取提取后的上清液2.0 mL于 2 mL 凈化管（7.5 mg Bulk Carbograph，50.0 mg PSA，50.0 mg C18EC，150.0 mg MgSO4）中，渦旋振蕩1 min，10 000 r/min 離心5 min。取凈化液經(jīng) 0.45 μm 有機微孔濾膜過濾，待GC-MS/MS測定。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：DB-5石英毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）;進樣口溫度為 250 ℃;升溫程序：100 ℃保持1 min，以40 ℃/min升至 160 ℃，保持0 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持 5 min，以8 ℃/min升至240 ℃，保持0 min，以 5 ℃/min 升至280 ℃，保持3 min，以30 ℃/min升至300 ℃，保持1 min;進樣方式：不分流進樣;進樣體積為1 μL;載氣為高純度氦氣，恒流模式，流量為 1.2 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件 傳輸線溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式為電離源（EI），電子能量為70 eV，溶劑延遲時間為3.5 min;采集模式：選擇離子監(jiān)測（SIM）和多離子監(jiān)測（MRM）模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

分別采用SIM和MRM模式對所檢測化合物進行掃描，并尋找到2種模式下化合物的掃描參數(shù)，同時建立2種掃描模式下化合物的檢測質(zhì)譜方法。為保證檢測的精確度和準確度，且在MRM模式下所得的信噪比較SIM模式下的信噪比高，最終選擇MRM模式對樣品進行定量檢測。2種掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 樣品前處理方法比較

方法一：稱取茶葉粉末2.00 g于10 mL離心管中，加入60 μL濃度為20 μg/mL的內(nèi)標工作液、2.0 mL 純水、2.0 mL乙腈、3.0 mL正己烷充分混勻，渦旋振蕩1 min，浸提10 min，再次渦旋振蕩 1 min，2 000 r/min離心5 min，收集上清液，待凈化。移取2.0 mL提取液置入裝有7.5 mg Bulk Carbograph、50.0 mg PSA、50.0 mg C18EC、150.0 mg MgSO4的凈化管中，振蕩1 min后，靜置5 min，凈化液經(jīng)0.45 μm有機微孔濾膜過濾，待GC-MS/MS分析。

方法二：稱取茶葉粉末2.00 g于10 mL離心管中，加入60 μL濃度為20 μg/mL的內(nèi)標工作液、4.0 mL 純水、3.0 mL正己烷充分混勻，渦旋振蕩 1 min，浸提10 min，再次渦旋振蕩1 min，2 000 r/min 離心5 min，收集上清液，待凈化。移取2.0 mL提取液置入裝有7.5 mg Bulk Carbograph、50.0 mg PSA、50.0 mg C18EC、150.0 mg MgSO4的凈化管中，振蕩1 min后，靜置5 min，凈化液經(jīng) 0.45 μm 有機微孔濾膜過濾，待GC-MS/MS分析。

以同一基質(zhì)樣品做添加0.2 mg/kg的標準濃度，分別按處理方法一、方法二進行前處理。經(jīng)比較，由方法一提取的樣品上清液顏色比方法二顏色深，但方法一的回收率高于方法二，其回收率比較見圖1。因此，選擇方法一作為本次樣品的前處理方法。

2.3 提取溶劑的選擇

農(nóng)藥殘留量檢測中常用的提取溶劑為乙腈、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、含1%乙酸的丙酮溶液、含1%乙酸的乙腈溶液等[14]。用乙腈提取時，茶葉提取液中的干擾組分最少，因此QuEChERS法普遍采用乙腈作為提取溶劑。乙腈極性較強，從而導致農(nóng)藥組分發(fā)生分裂，造成定量結(jié)果不準確。同時，用乙腈提取后直接進樣，對色譜柱和檢測器的損害較大，多次進樣后，色譜峰發(fā)生不可逆拖尾。因此用乙腈提取時，常常須要采用濃縮、溶劑轉(zhuǎn)換后才能進行檢測，在一定程度上增大了農(nóng)藥在轉(zhuǎn)換過程中的損失風險，且增大了工作人員的勞動量。因此，本試驗選擇乙腈和正己烷作為提取溶劑，并以上清液正己烷作為檢測液，一方面能保證茶葉中的農(nóng)藥被充分提取，另一方面也避免了農(nóng)藥組分在濃縮、溶劑轉(zhuǎn)換中的損失，更簡化了試驗步驟，也避免了濃縮、溶劑轉(zhuǎn)換過程中由于試驗人員的操作而引起的殘留農(nóng)藥的損失。

2.4 基質(zhì)效應考察

基質(zhì)效應是農(nóng)藥殘留檢測中通常遇到的問題[11]，茶葉樣品基質(zhì)成分復雜，在氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析中，基質(zhì)效應的存在不可避免，對于GC-MS/MS法測定農(nóng)藥殘留通常有基質(zhì)增強作用，而采用LC-MS/MS測定時，通常有基質(zhì)抑制作用[12]，通常的解決辦法有用空白基質(zhì)配制標準曲線[10]、稀釋法和加入保護劑法[11-12]。本研究配制了茶葉基質(zhì)的基質(zhì)標準溶液和同濃度的溶劑標準溶液，并對同一質(zhì)量濃度均為 0.50 μg/mL 的標準工作液和基質(zhì)標準工作液進行對比，對基質(zhì)效應進行考察，試驗中以ME=Slopi/Slopo評價基質(zhì)效應，其中ME為基質(zhì)效應，Slopi為基質(zhì)匹配標準曲線的斜率，Slopo為純?nèi)軇藴是€的斜率[15]，或者以如下公式進行計算：

基質(zhì)效應=（基質(zhì)標樣峰面積-純?nèi)軇藰臃迕娣e）/純?nèi)軇藰臃迕娣e×100%。

基質(zhì)干擾的大小即基質(zhì)效應在80%以下視為強基質(zhì)抑制效應，在80%～120%之間視為弱基質(zhì)效應，在120%以上視為強基質(zhì)增加效應[16-22]。基質(zhì)效應結(jié)果見表2，濃度為0.50 μg/mL的響應值比較見圖2。通過試驗發(fā)現(xiàn)，在所檢測的28種農(nóng)藥中，僅有8種農(nóng)藥的基質(zhì)效應在80%～120%之間，屬弱基質(zhì)效應，其余都出現(xiàn)基質(zhì)效應增強的趨勢。試驗采用基質(zhì)匹配校準曲線對樣品中的農(nóng)藥進行定量分析，對基質(zhì)效應進行補償，用以抵消基質(zhì)效應的影響。

2.5 凈化劑種類及用量的選擇

茶葉中含有大量的色素、生物堿、甾醇、多酚類、水分等干擾物質(zhì)。其中，水分會影響檢測器的正常檢測，并會對色譜柱的固定相造成化學損傷;茶多酚類物質(zhì)是茶葉中的最主要干擾成分;葉綠素是茶葉中最直接可見的色素類干擾成分。因此，本研究在2 mL凈化管中加入7.5 mg Bulk Carbograph、50.0 mg PSA、50.0 mg C18EC、150.0 mg MgSO4或150 mg PSA、45 mg GCB、900 mg MgSO4。對比2種凈化劑對提取液中茶多酚和葉綠素的凈化能力，通過分析，采用第一種凈化劑凈化后，28種農(nóng)藥的回收率的確比后者高，且凈化后的樣品顏色更淺。因此，采用第一種凈化方式進行凈化。

2.6 內(nèi)標的選擇

在茶葉基質(zhì)干擾下，農(nóng)藥在前處理過程中易被吸附、降解和損失，因此采用內(nèi)標法定量可以提高定量結(jié)果的準確性，本試驗以阿特拉津作為內(nèi)標物進行定量分析。

2.7 方法的線性范圍和檢出限、定量限

本試驗用紅茶作為空白樣品，按“1.3.2”節(jié)制備基質(zhì)提取液，并用基質(zhì)提取液配制標準工作曲線序列。各種目標化合物響應值不同，在一定的含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.995。以3倍信噪比時對應的含量定位方法的檢出限，為0.10～5.00 μg/kg;以10倍信噪比時對應的含量定位方法定量限，為0.30～15.00 μg/kg，方法的線性方程、檢出限及定量限見表3。

2.8 方法的精密度和準確度

以樣品空白進行高、中、低不同水平添加各試劑，平行6次試驗，得到加標回收率為63.9%～102.9%，相對標準偏差（RSD）為2.05%～7.02%;其精密度和準確度可以滿足分析要求，加標結(jié)果見表4。

2.9 實際樣品測定

應用建立的分析方法對紅茶、綠茶2個類別30件樣品進行農(nóng)藥殘留檢測，發(fā)現(xiàn)在綠茶和紅茶中均檢出甲胺磷、毒死蜱、敵敵畏、聯(lián)苯菊酯、氯菊酯、乙拌磷、甲基對硫磷等農(nóng)藥殘留的樣品，圖3為綠茶中檢出殘留農(nóng)藥的多反應監(jiān)測色譜圖。

3 結(jié)論

本試驗采用乙腈和正己烷共同作為提取溶劑，并以上清液正己烷作為檢測溶液，經(jīng)Bulk Carbograph、PSA、C18EC和MgSO4混合凈化劑凈化，以GC-MS/MS法檢測，建立了檢測茶葉中28種農(nóng)藥殘留的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。本試驗的方法與傳統(tǒng)的提取方法相比，可直接使用正己烷進行提取進樣，前處理更為方便，并減少了溶劑轉(zhuǎn)換過程中農(nóng)藥成分的損失，提高了回收率。本試驗的方法操作簡便、快速、準確可靠，可以用作茶葉中多種農(nóng)藥殘留量的檢測方法。

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