甜薯脫毒苗快速繁殖技術(shù)

吳凡 陳閩 劉佳

摘要：以甜薯的莖尖和單節(jié)莖段為試驗(yàn)材料，研究不同濃度激素組合對(duì)甜薯不定芽及再生植株的影響，從而建立一套甜薯快速繁殖體系。結(jié)果表明，莖尖誘導(dǎo)出芽最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.1 mg/L+KT 2.0 mg/L，單節(jié)莖段誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+AD 0.8 mg/L，增殖最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg/L+KT 2.0 mg/L，生根最佳培養(yǎng)基為MS+IBA 2.0 mg/L。該方法能夠提高甜薯繁殖系數(shù)，提高甜薯品質(zhì)與產(chǎn)量，為甜薯產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：甜薯;脫毒苗;莖尖;單節(jié)莖段;快速繁殖技術(shù)

甜薯[Dioscorea esculenta （Lour） Brukill]，別稱甘薯、毛薯、蒂薯，與山藥同為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea L.）藤本植物[1]，海南、廣東、廣西等南方沿海地區(qū)廣泛分布，浙江、江蘇則有少量分布。其莖塊顏色為白色，肉質(zhì)細(xì)嫩，既含豐富的多糖、淀粉、蛋白質(zhì)等成分[2]，又具有健脾止瀉、益肺滋腎、解毒斂瘡等功效[3]。除了豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和良好的藥用價(jià)值，甜薯還具有耐儲(chǔ)藏、抗旱性好、病蟲害少、單株結(jié)薯多且集中等特性[4]，便于生產(chǎn)管理，是值得研究和開發(fā)利用的特色薯類作物。

甜薯的種植方式與傳統(tǒng)的山藥種植方法類似，即在收獲季節(jié)選健壯、無病蟲害的塊莖貯藏，次年種植季節(jié)取出切斷種植，但這種傳統(tǒng)的“春種、秋收、冬藏”方式存在種塊嚴(yán)重浪費(fèi)、擴(kuò)殖速度慢、人力物力消耗大等問題。而且，長(zhǎng)期的無性繁殖導(dǎo)致病毒和病害的積累與傳播，致使品質(zhì)退化、產(chǎn)量下降[5]。

前人研究表明，通過組織培養(yǎng)脫除病毒的方法不僅可以極大地提高薯蕷屬植物繁殖系數(shù)，而且還可以解決因長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖造成的病毒病和品質(zhì)退化等問題[6-8]。目前，在山藥不同種或品種如鐵棍山藥（D. opposita Thunb. cv. Tiegun）、淮山藥（D. opposita）、叉蕊薯蕷（D. collettii HK. f.）、參薯（D. alata L.）等中已有成功報(bào)道[6，9-11]，但甜薯中尚未見相關(guān)研究。本研究以甜薯為研究對(duì)象，通過不同外植體、不同激素種類與濃度處理等試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選最佳試驗(yàn)條件，建立甜薯組織培養(yǎng)的最佳試驗(yàn)體系，以期為甜薯脫毒苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)，也為甜薯后續(xù)的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中的外植體材料取自南京中山植物園，采集時(shí)間為6月中旬，選取生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的植株，將枝蔓上部3～5 cm的嫩莖或約1 cm的莖尖取下，先用自來水沖洗，然后泡在無菌水中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的制備 在超凈工作臺(tái)上，先將外植體用75%乙醇消毒10～15 s，然后用0.1% HgCl2溶液浸泡3～5 min，最后用無菌水沖洗3～5次。將消毒后的莖尖、單節(jié)莖段分別切成0.5、1 cm 左右的長(zhǎng)度，以備后續(xù)使用。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 莖尖芽誘導(dǎo)：以MS基本培養(yǎng)基[蔗糖30 g/L、瓊脂10 g/L、pH值5.8、0.1% PVP（聚乙烯吡咯烷酮）]附加不同濃度NAA（萘乙酸）、6-BA（6-芐氨基嘌呤）和KT（激動(dòng)素），共設(shè)5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)（表1），每個(gè)處理10瓶，每瓶接種3個(gè)。30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

叢生芽繁殖系數(shù)=誘導(dǎo)芽總數(shù)/莖尖萌發(fā)數(shù)。

單節(jié)莖段芽誘導(dǎo)：以MS基本培養(yǎng)基[蔗糖 30 g/L、瓊脂10 g/L、pH值5.8、0.1% PVP（聚乙烯吡咯烷酮）]附加不同濃度AD（腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、KT（激動(dòng)素），共設(shè)7個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)（表2），每個(gè)重復(fù)10瓶，每瓶接種3個(gè)。30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

單節(jié)莖段誘導(dǎo)率=形成不定芽數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 選取生長(zhǎng)健壯、無玻璃化的再生苗的莖尖和帶腋芽莖段進(jìn)行繼代增殖。繼代增殖培養(yǎng)基在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上適當(dāng)調(diào)整，附加不同濃度NAA和KT，共設(shè)3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)（表3）。

增殖倍數(shù)=發(fā)芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 芽苗長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，選取生長(zhǎng)健壯的無根苗接種于生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，30 d后統(tǒng)計(jì)組培苗生根率。

生根培養(yǎng)基采用1/2 MS培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA（0.5、1.0、0.2 mg/L）或IBA（0.5、1.0、2.0 mg/L），共設(shè)4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

生根率=生根苗總數(shù)/接種的無根苗總數(shù)×100%。

1.2.5 培養(yǎng)條件 以上試驗(yàn)均在溫度（25±2） ℃、光照16 h、光照度2 000 lx的條件下進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素處理莖尖芽誘導(dǎo)情況

在添加不同濃度NAA、6-BA和KT的培養(yǎng)基上進(jìn)行甜薯莖尖組培苗試驗(yàn)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，激素的6種濃度組合處理均可誘導(dǎo)出芽（圖1-A），但叢生芽的繁殖系數(shù)在不同處理間差異很大，其中處理2繁殖系數(shù)最高，為5.0。觀察發(fā)現(xiàn)，處理2開始出芽的時(shí)間也較其他處理短，約為3周。因此，NAA 0.1 mg/L+KT 2.0 mg/L的激素配比是莖尖誘導(dǎo)出芽的最適條件。

2.2 不同激素處理單節(jié)莖段芽誘導(dǎo)

在添加不同濃度AD、NAA和KT的培養(yǎng)基上進(jìn)行甜薯單節(jié)莖段組培苗培養(yǎng)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，激素的6種濃度組合處理均可誘導(dǎo)出芽（圖1-B），其中處理6的誘導(dǎo)率最高，且在誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)芽苗長(zhǎng)出后會(huì)繼續(xù)長(zhǎng)葉生根，這可能是由于培養(yǎng)基中激素被消耗后濃度降低，適合生根需求。因此，單節(jié)莖段誘導(dǎo)出芽的最適激素濃度是AD 0.8 mg/L。

2.3 繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)出不定芽

將誘導(dǎo)出的不定芽分別接種到含有不同濃度NAA和KT的1～3號(hào)培養(yǎng)基中，結(jié)果（表3）表明，在3號(hào)培養(yǎng)基中的芽苗既有增殖生長(zhǎng)又有伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，增殖倍數(shù)高，培養(yǎng)30 d可達(dá)4.8，且芽苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛。在1號(hào)培養(yǎng)基中芽苗伸長(zhǎng)生長(zhǎng)明顯，芽體粗壯，但增殖倍數(shù)較低。在2號(hào)培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)較好，芽苗增殖倍數(shù)較高，但新芽細(xì)小。因此，NAA 0.5 mg/L+KT 2.0 mg/L是最適合甜薯組培苗增殖培養(yǎng)的激素濃度組合。

2.4 不同激素處理組培苗生根的影響

在不同濃度AD培養(yǎng)基上進(jìn)行甜薯組培苗的生根培養(yǎng)，結(jié)果（表4）表明，3個(gè)培養(yǎng)基都可以誘導(dǎo)根產(chǎn)生（圖1-C、圖1-D），其中2號(hào)培養(yǎng)基的生根率最高，為95%，且生根所需時(shí)間最短，僅需2周。此外，綜合評(píng)價(jià)生根數(shù)量及質(zhì)量，2號(hào)培養(yǎng)基均優(yōu)于其他2個(gè)培養(yǎng)基。因此，IBA 2.0 mg/L是最適合甜薯組培苗生根培養(yǎng)的激素濃度。

3 討論與結(jié)論

要想建成甜薯組織培養(yǎng)的最佳試驗(yàn)體系，取材是構(gòu)建甜薯組織培養(yǎng)最佳試驗(yàn)體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)組培苗培養(yǎng)成敗有很大影響[8]。本試驗(yàn)以莖尖和單節(jié)莖段為外植體，均能誘導(dǎo)出芽，因外植體來源不同，各外植體誘導(dǎo)率與芽的狀態(tài)有明顯區(qū)別，而通過節(jié)段發(fā)生途徑可以直接誘導(dǎo)出芽，最初為綠色芽點(diǎn)，很快就伸展并長(zhǎng)出小葉片，可以繼代增殖，而且所需時(shí)間比莖尖誘導(dǎo)出芽短，由此判定甜薯組織培養(yǎng)的最佳外植體是節(jié)段。此外，同一器官的不同部位以及不同取材時(shí)間也是影響組織培養(yǎng)效果的重要因素[12]。幼嫩的外植體容易出芽，而越老的外植體越容易褐化，并且越難出芽生長(zhǎng)。眾多研究報(bào)道，外植體直接誘導(dǎo)出芽是組培快繁技術(shù)的重要選擇之一[13-14]，而且通過愈傷長(zhǎng)期的繼代分化，可能會(huì)使細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生能力下降甚至喪失。通過莖尖和單節(jié)莖段出芽，其芽和分生組織培養(yǎng)不像愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)那樣容易發(fā)生變異，這種方法產(chǎn)生的克隆植株表現(xiàn)出高度的一致性，且遺傳性狀穩(wěn)定，開辟了加速優(yōu)良品種大量繁殖的途徑[15]。

組培苗生根對(duì)于生產(chǎn)十分重要，但由于甜薯生根率并不高，在筆者篩選出的培養(yǎng)條件下的生根率很高，有利于高效地生產(chǎn)繁殖。雖然沒有經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷途徑誘導(dǎo)甜薯植株再生，但筆者已經(jīng)摸索出其最佳的快速繁殖體系，將有助于甜薯脫毒苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ding Z C，Michael G G. Dioscoreaceae[M]. Beijing：Science Press，2000：276-296.

[2]黎 丹，吳文嬙，黃東益，等. 毛薯的營(yíng)養(yǎng)成分分析和聚類分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2018，39（3）：167-172.

[3]王弗能，王天云，汪飛杰. 海南島大薯、毛薯等資源考察初報(bào)[J]. 作物品種資源，1991（2）：8-9.

[4]余文慧，張富仙，邵曉偉. 浙西地區(qū)特色旱糧毛薯的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（6）：826.

[5]崔茂坤. 毛薯（山藥）的高產(chǎn)栽培[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技，1986（3）：37-38.

[6]韓曉勇，閆瑞霞，殷劍美，等. 鐵棍山藥組織培養(yǎng)快繁及試管珠芽離體再生體系研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2013，33（10）：2120- 2125.

[7]Barz W，Reinhar E，Zenk. Plant tissue culture and its bio-technological application[M]. Berlin：Sprinser-Verlag Berlin Heidelberg，1977：277-343.

[8]Chaudhury A，Qu R D. Somatic embryogenesis and plant regeneration of turf-type bermudagrass：effect of 6-benzyladenine in callus induetion medium[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture，2000，60（2）：113-120.

[9]李明軍，楊建偉，張嘉寶，等. 懷山藥的莖段培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊，1997，33（4）：275-276.

[10]夏 赟，譚文麗，陳銀華，等. 參薯組織培養(yǎng)快繁技術(shù)[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)，2012，3（3）：271-275.

[11]張宗勤，撒文清，劉建才. 叉蕊薯蕷的繁殖及微型薯蕷的離體誘導(dǎo)[J]. 生物技術(shù)，1998，8（1）：18-26.

[12]李明軍. 懷山藥莖段愈傷組織的誘導(dǎo)與多芽體的形成[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2000，15（2）：85-87.

[13]陳艷莉，劉艷萌，張學(xué)英. 薯蕷莖段組織培養(yǎng)的研究[J]. 長(zhǎng)江蔬菜，2008（10）：32-34.

[14]林貴美，牟海飛，李 邦，等. 菊葉薯蕷莖段組織培養(yǎng)研究[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，37（6）：710-712.

[15]鄭曉琴，梁國(guó)魯. 薯蕷的快速繁殖及零余子的離體誘導(dǎo)[J]. 西南園藝，2003（2）：20-21.卻志群，黃貴忠，沈春修. 東鄉(xiāng)野生稻苗期耐冷QTL qCTS3.3候選基因LOC_Os03g54970冷脅迫下熒光定量表達(dá)分析及克隆[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（12）：39-44.