我院136株流感嗜血桿菌分離特點及耐藥性分析

王玉潔,國 霞,王曉飛

(青島市市立醫院 1.檢驗科； 2.腫瘤科， 山東 青島266001)

流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza,Hi)是一種短小的革蘭陰性桿菌，分布在咽部、鼻部及鼻咽部，是條件致病菌，也是引起社區性肺炎的主要致病菌。在住院患者免疫力較低情況下容易引起肺炎及氣管炎，也可合并支氣管擴張、COPD感染。國內有學者研究顯示，當患者年齡在60歲以上，Hi感染并合并其他多種嚴重基礎疾病，有引起死亡可能[1]，與國外報道一致[2]。Hi是一種苛養菌，生長需要v因子與x因子，菌落生長緩慢、細小，與副流感桿菌混淆，容易被忽視掉，是一種需要重點關注的條件致病菌。

1 材料與方法

1.1 菌株來源回顧性整理我院2015年12月至2018年11月間分離出的Hi136株，標本來源為痰標本133例、傷口分泌物1例、胸腹水2例。

1.2 標本采集清洗口腔后咳出深部痰標本或抽取痰，無菌痰杯盛取。抽取無菌體液及膿液標本，無菌管盛取，2 h內送檢。

1.3 試劑5%綿羊血培養基、麥康凱培養基、巧克力培養基、HTM培養基、質譜儀、頭孢硝噻吩試紙片為法國梅里埃公司產品；藥敏標準紙片為英國Oxoid公司產品；金黃色葡萄球菌標準菌株為ATCC25923，Hi標準菌株為ATCC49247，由山東臨檢中心購置。

1.4 方法

1.4.1細菌鑒定 痰標本涂片符合規范要求，上皮細胞≤10個/低倍鏡，白細胞≥25個/低倍鏡。標本于2 h內接種血平板、麥康凱和巧克力平板， 35℃±1℃，5%-10%CO2孵箱培養18-48 h。挑取圓形、濕潤、透明小菌落，金葡標準菌株ATCC25923衛星試驗陽性，經MS鑒定確認為Hi。

1.4.2分組 按照季節性分離情況分為春夏秋冬4組，春季3月1日至5月31日，夏季6月1日至8月31日，秋季9月1日至11月30日，冬季12月1日至2月28日。 按科室分離情況選取前六位，分別為呼吸科、重癥監護科、心血管、腎臟科、燒傷科、及內分泌科。

1.4.3生物學分型 根據對吲哚、脲酶、鳥氨酸脫羧酶3種生化反應結果對比，對分離Hi進行生物學分型。共分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅶ型、Ⅴ-Ⅷ型8個生物型。

1.4.4藥敏 頭孢硝噻吩試紙片法沾取菌落檢測β-內酰胺酶，紅色為陽性，不變色為陰性，對照質控菌株ATCC49247。藥敏試驗紙片分別有氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、阿奇霉素、四環素、氯霉素、頭孢呋辛、環丙沙星、頭孢他啶、頭孢噻肟、復方磺胺。標準K-B法，HTM培養基，準確量取直徑。結果判定參照CLSIM100標準，分敏感、中介、耐藥3種結果。

1.4.5統計學分析 實驗室數據使用WHONET5.6軟件統計分析。

2 結果

2.1 按季節分離分組比較冬季61株(44.9%)，春季44株(32.4%)，秋季22株(16.2%)，夏季9株(6.7%)，冬季、春季明顯增多。

2.2 按科室分離分組比較分離排名前6位科室菌株及占比：呼吸科61株(44.9%)，心臟內科31株(22.8%)，ICU15株(11.0%)，腎臟科11株(8.1%)，燒傷科11株(8.1%)，內分泌科7株(44.9%)，以呼吸科最多，且多數患者伴隨基礎疾病。

2.3 β-內酰胺酶檢測結果經頭孢硝噻吩試驗，β-內酰胺酶陽性菌株55株(40.4%)，其中49株氨芐西林耐藥，6株氨芐西林中介。β-內酰胺酶陰性菌株81株(59.6%)，其中氨芐西林耐藥3株，中介2株。

2.4 生物學分型情況根據對吲哚、脲酶、鳥氨酸脫羧酶3種生化反應結果對136株Hi進行生物學分型，Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型最多，Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型未發現。產酶率Ⅰ型最低(10%)，見表1。

表1 136株Hi生物學分型結果及產酶率(%)

2.5 臨床常用抗生素的藥敏結果氨芐西林耐藥率38.2%，復方新諾明耐藥率65.38%。阿奇霉素、氯霉素、四環素、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸的敏感率均大于80%，頭孢呋辛、頭孢噻肟的敏感率均>90%，分離2株環丙沙星耐藥株，敏感率98.5%，見表2。

表2 136株Hi對10種抗菌藥物的藥敏結果(%)

3 結論

Hi是一種革蘭陰性小桿菌，菌落細小，無色透明，生長緩慢，臨床經驗不足的初學者往往忽略其生長，容易漏檢，造成臨床分離率低。Hi營養要求高，分離需要v因子、X因子。加萬古霉素的巧克力培養基，不僅含有X因子，v因子在加熱過程中也被釋放出來，在培養基中加入萬古霉素，還可有效的抑制其他革蘭陽性球菌生長，提高分離率，必要時培養應延長至48 h。挑選可疑菌落時，應注意與副流感嗜血桿菌、溶血嗜血桿菌與副溶血嗜血桿菌相鑒別。本研究標本全部來自我院住院患者，標本采集按照第4版《全國臨床檢驗操作規程》微生物標本采集要求執行。本實驗室對疑似Hi菌株首先用金匍標準菌株ATCC25923做衛星試驗(同時用血平板、MH平板做副流感鑒別)。挑選衛星試驗陽性菌落再進行質譜鑒定確認，最終鑒定為Hi。

本研究通過春夏秋冬4個季節對Hi菌株分布做統計分析，冬季分離菌株61株， (44.9%)，春季44株(32.4%)，以冬、春最多，有明顯的季節性。在患者科室統計中，呼吸科病人最多61例(44.9%)，心內科31例(22.8%)次之。病種統計多為肺炎、支氣管炎、支擴及COPD感染。有研究顯示[1]，Hi是造成CAP和HAP主要病原菌，這些病人以老年人及重癥病人居多，多臥床不能自理，免疫力低，感染機會增加，且合并多種基礎疾病，嚴重者可引起死亡，與本文的研究一致(本院兒科住院患者痰標本送檢少，獲得數據也較少，3年僅2例)。

根據對吲哚、脲酶、鳥氨酸脫羧酶3種生化反應結果Hi可分為Ⅰ-Ⅷ八個生物型，文獻報道，生物Ⅰ型與兒童腦膜炎有關，生物Ⅱ型、Ⅲ型主要引起肺炎和上呼道感染[3]。有研究認為Hi在不同地區生物學分型，存在區域性差異[4]，即使在同一地區，不同醫院或年齡不同，Hi生物學分型也存在差異性[1]。也有研究證明，生物學分型與感染的不同類型、抗原性質、抗生素耐藥類型有關[5]，有地域差別。本研究Hi生物分型主要以Ⅱ型(36.0%)、Ⅲ型(31.6%)、Ⅳ型(23.5%)為主，Ⅰ型(7.4%)、Ⅶ型(1.5%)較少，Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型未發現，與陳碧英等[6]研究不一致。而楊旭等[7]認為Hi生物分型以Ⅳ型為主(69.5%)，與本研究不一致。本研究Hi產酶菌株55株，產酶率分別為Ⅰ型10%、Ⅱ型57.1%、Ⅲ型51.2%、Ⅳ型12.5%，總產酶率40.4%。有學者認為Hi產酶率成人和兒童有較大不同，兒童高于成人，差異有顯著性[8]。

一直以來氨芐西林是Hi感染的首選抗生素，隨著抗菌藥物的不規范使用，耐藥菌株出現，使氨芐西林耐藥性逐年升高，本研究統計本院氨芐西林的耐藥率為38.2%，和歐洲的耐藥率16.8%[9]比較有差別，也有文獻報道某地區兒童醫院氨芐西林耐藥K-B法達49.07%，MIC法達到了82.2%[10]。本研究β-內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥(β-lactamase negative ampicillin resistant,BLNAR)3株，β-內酰胺酶陰性氨芐西林中介(β-lactamase negative ampicillin intermediates,BLNAT)2株，其耐藥機制是可能是由于菌株細胞壁上一種或多種青霉素結合蛋白發生改變，引起青霉素結合蛋白與靶位親和力降低，還可能與外膜結合蛋白改變導致耐藥有關[8]，應當引起重視。本研究Hi對復方磺胺表現較高耐藥性，達到65.38%，對阿奇霉素、氯霉素、四環素、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢噻肟、環丙沙星的敏感率達80%-90%。不管是β-內酰胺酶陽性或β-內酰胺酶陰性菌株，對三代頭孢都有較好的敏感性[11]，這和國外研究證明一致。Hi對氨芐西林的耐藥機制是菌株產生質粒介導的β-內酰胺酶，主要是TEM-I型酶，其次是ROB-1型酶[12]。國內學者研究報道，β-內酰胺酶檢出基因均為TEM-I型,未見ROB-1型[13,14]。國外學者研究顯示，β-內酰胺酶TEM-I型酶占93.7%，ROB-1型酶占4.6%[12]，幾乎所有產ROB-1型酶菌株均出現在北美[15]。

綜上所述，通過本院病例分析，Hi分離有季節性差別，以春、冬兩季為主，感染者以呼吸科患者為主，其他患有基礎疾病的患者感染機會較多。Hi生物分型主要以Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型為主。氨芐青霉素和復方磺胺已不再作為感染的Hi首選藥物，三代頭孢、紅霉素、四環素、環丙沙星敏感率高。其中β-內酰胺酶陰性，氨芐西林耐藥或中介(BLNAR或BLNAT)菌株因為細胞壁的改變導致對藥物的親和力降低引起耐藥應當引起重視。