弱磁場對胰蛋白酶活性和構象的影響

,2,*,2

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江舟山 316022;2.浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室,浙江舟山 316000)

近年來現有的抗生素對于耐藥的“超級細菌”的控制已經越發困難。因此,迫切需要開發新型抗菌劑[1]。生物活性肽通常是含有2～20個氨基酸殘基的特定的蛋白質片段[2],具有如抗菌、抗氧化等生理功能同時，還可以被人體很好地吸收和利用。因此,生物活性小肽可以篩選藥物以及作為功能性食品的主要原料[3],其中海洋生物源抗菌肽因其優越的營養功能和廣泛的生物學活性,被認為是最優質的抗菌肽類型之一[4]。

酶解法因其成本低,反應進程易控制等優點成為了處理魚類肌肉和加工副產物生產抗菌肽的一種重要方法。但酶解法對于大多數抗菌肽來說較為劇烈,抗菌肽的抗菌活性很容易在酶解過程中遭到破壞[5]。因此,較多研究集中于優化抗菌肽生產過程中的酶源、溫度、pH和酶/底物比例,然而所獲得的抗菌肽的活性仍有待提高[6-8]。

弱磁場在改變酶催化活性的同時對酶的構象也會產生影響,而蛋白質微小的構象改變對其生物功能也會造成很大的影響[13]。肖祖峰等[14]認為電磁場可降低傳質過程的活化能,強化擴散。薛麗萍等[15]利用極低頻交變磁場處理過氧化氫酶時,發現不同處理溫度、磁場強度和頻率及酶液pH都會影響酶的二級結構。

胰蛋白酶具有一定的專一性,但是該專一性是相對的,該酶對多種類型的肽鍵都可以水解。胰蛋白酶的這種相對專一性為水解復雜蛋白質成小分子抗菌肽提供了可能。由于胰蛋白酶的活性中心含有決定其功能的Zn2+,在受到外加磁場的作用后,因為洛倫茲力的影響就有可能改變酶活性[16]。同時,酶分子多肽鏈具有一定的剛性結構,但其側鏈是通過單鍵與主鏈相連,故具有相當大的柔性和一定的自由運動能力[17],因此酶分子側鏈在磁場作用下會受到較大的擾動,取向分布發生變化,從而導致構象改變[18-19]。

課題組在前期研究中采用不同強度(50、100、150 mT)的弱磁場處理胰蛋白酶后,發現100 mT磁場處理后的胰蛋白酶水解梅魚獲得的酶解液抑菌效果顯著高于其他磁場強度,因此,本論文擬采用100 mT磁場處理胰蛋白酶,并用其水解梅魚蛋白,以探究弱磁場處理對胰蛋白酶酶解液抗菌能力、胰蛋白酶活性與結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅魚 舟山國際水產城;胰蛋白酶(25000 U/g) 上海金穗生物科技有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonellasp)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus) 浙江海洋大學食品與醫藥學院食品工程實驗室提供;其他試劑 均為國產分析純。

S-3C型pH計 上海虹益儀器儀表有限公司;A-1502紫外可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司;NICOLET NEXUS67紅外可見光譜儀 美國Beckman公司;Bencbtop K型真空冷凍干燥機 上海齊欣科學儀器有限公司;日立L-8900全自動氨基酸分析儀 日立高新技術公司;JASCO-1500圓二色CD光譜儀 英國Applied Photo Physics公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 弱磁場處理裝置 實驗采用的弱磁場處理裝置如圖1所示。磁場由一組直徑40 cm的亥姆霍茲線圈產生,線圈上纏繞銅線150圈,線圈之間相隔20 cm,在線圈中軸線附近可產生均勻的、方向垂直的磁場。將受試樣品置于中軸線附近,磁場激發波形和振幅可通過示波器進行控制。采用數字式高斯計軸向電極檢測磁場強度。

圖1 弱磁場裝置Fig.1 Weak magnetic field device

1.2.2 弱磁場處理胰蛋白酶 室溫(25 ℃)下將1 g胰蛋白酶(25000 U/g)溶于100 mL蒸餾水中,磁場強度參數為100 mT,樣品置于線圈中心處理2 h后保存備用。

1.2.3 梅魚蛋白酶解液的制備 將梅魚的頭、內臟及大的魚骨去掉,清洗剩下的魚肉,瀝水后用攪拌機攪碎,將攪碎的魚肉裝袋,放入冰箱冷凍保存。取梅魚魚肉100 g,加入900 mL蒸餾水,將pH調至8,隨后室溫(25 ℃)下將弱磁場處理后的胰蛋白酶按照 25000 U/100 g的比例加入魚糜液中,以不經磁場處理的胰蛋白酶作為對照組,在胰蛋白酶最適條件水浴攪拌水解至一定時間,水解結束后置于100 ℃水浴鍋滅活10 min,待酶解液冷卻后在10000 r/min、4 ℃條件下離心15 min,取上清液備用。

1.2.4 抗菌活性測定 將冷凍保存的菌種劃線接種至平板培養基,37 ℃培養24 h后挑單菌落接種至100 mL液體培養基,37 ℃、200 r/min搖床培養過夜制得菌液加入到冷卻至50 ℃左右的平板培養基中,混合均勻,傾注平板(約20 mL/平板),水平靜置凝固后備用。

采用牛津杯平板法,將指示菌固體培養基融化冷卻后倒平板,待平板凝固后,均勻放入牛津杯,再將指示菌半固體培養基融化后冷卻至45～50 ℃,把100 μL的指示菌液接入指示菌半固體培養基中,倒平板。待平板凝固后再將牛津杯拔出,在孔中加入10 mg/mL磁場處理前后的梅魚蛋白酶解液100 μL,40 ℃擴散2 h,37 ℃培養24 h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑以表征其抗菌活性[20]。

1.2.5 酶活性測定 將TAME 29.0 mg溶于50 mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中,定容至100 mL配置成底物緩沖液。測定時,向比色皿中加入2.8 mL底物緩沖液再與0.2 mL預熱至25 ℃的酶液混勻,在247 nm下檢測吸光值,每30 s讀數一次,共計5 min。然后根據時間間隔與相應的吸光值的增量(ΔA247)來計算胰蛋白酶的活性,在1 min內引起吸光度增加 0.001 所需的酶量為一個酶活單位(U/min)。酶活的計算公式為:

1.2.6 氨基酸測定 將經弱磁場處理后的胰蛋白酶放入離心管中,隨后放置-18 ℃冰箱中冷凍,待冷凍完全后取出樣品放置真空冷凍干燥機中進行干燥處理,48 h后取出樣品,密封后放置于冰箱保存待用。對照組胰蛋白酶處理方法同上。先稱取20 mg樣品,將樣品放置于玻璃試管,隨后向玻璃試管中加入5 mL 6 mol/L的HCl,渦旋60 s混勻,隨后氮吹5 min,于110 ℃條件下加熱分解22 h,冷卻至室溫,并定容至50 mL。取1 mL樣品加入15 mL離心管中,再用0.02 mol/L的HCl定容至5 mL,經漩渦離心后,取1 mL過0.45 μm濾膜后上氨基酸分析儀進行分析[21]。

1.2.7 紅外光譜 按照1.2.2的方法處理胰蛋白酶,分別取未經弱磁場處理的胰蛋白酶樣品及弱磁場處理2 h的樣品同溴化鉀在室溫(25 ℃)下混合,壓片,放入紅外光譜掃描儀中進行掃描。以波數為橫坐標,透光率為縱坐標,分析其紅外光譜的變化[22]。

1.2.8 圓二色譜(CD) 本文選用Feng等[23]的方法加以修改,配制質量濃度為0.15 g/L的胰蛋白酶,每次進樣量為 400 μL,室溫25 ℃,掃描范圍為190～250 nm,分辨率為0.1 nm,掃描速度為100 nm/min,響應度為0.5 s,CD靈敏度為0.01×10-3,光譜帶寬為1.0 nm,掃描3次,取平均值。

1.3 數據處理

實驗所得數據均用Origin Pro 8.5軟件作圖,通過SPSS 22.0軟件進行結果統計分析,試驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 弱磁場處理胰蛋白酶對梅魚蛋白酶解液抗菌活性的影響

如表1所示,利用100 mT磁場處理胰蛋白酶并用其水解梅魚蛋白,單位濃度酶解液對各種選擇的指示菌的抑菌率都得到提高(以抑菌圈為指標),其中大腸桿菌(Escherichiacoli)指示菌抑菌圈直徑由(4.71±0.22) mm提高至(8.54±0.23) mm，且差異顯著,表明弱磁場處理會增強酶解抗菌液的抗菌活性,經弱磁場處理獲得的酶解抗菌液抗菌活性均高于不經磁場處理的對照組。推測磁場會改變胰蛋白酶的空間結構進而調整胰蛋白酶的專一性,提高胰蛋白酶的活性進而導致酶解液的抗菌活性提高。

表1 磁場處理前后胰蛋白酶解梅魚蛋白所獲酶解液的抗菌活性Table 1 Antibacterial activity of enzymatic hydrolysate produced by small yellow croaker hydrolyzed by trypsin untreated and treated by weak magnetic field

2.2 弱磁場處理對胰蛋白酶活性的影響

由圖2可知,經磁場處理后的胰蛋白酶活性有所增高,磁場處理2 h后,酶活為368.5 U/min,相較于未處理組的316.0高出了52.5 U/min,表現為顯著性提高。因此,磁場處理對胰蛋白酶的活性的具有一定的影響,在一定程度上,胰蛋白酶的活性會因為磁場的處理而升高。據報道,胰蛋白酶是依賴于順磁性金屬離子Zn2+的金屬蛋白酶,而Zn2+對弱磁場作用比較敏感,酶活性中心結構受外加磁場的影響后導致酶構象改變進而導致酶活性變化[16]。此外,磁場處理也會改變水溶液的粘度、表面張力、電導率等物理化學性質,因此也可能通過影響水分子的結構改變水中氫鍵的長度和強度,從而使酶的構象發生改變進而導致酶活變化[24]。

圖2 弱磁場處理前后的胰蛋白酶活性Fig.2 Activity of trypsin enzyme untreated and treated by weak magnetic field注:不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05。

2.3 弱磁場處理對胰蛋白酶氨基酸種類及含量的影響

由表2可知,弱磁場處理之前胰蛋白酶中的氨基酸總量為67.924 mg/g,其中必需氨基酸含量為26.513 mg/g,占總氨基酸的39.03%。經弱磁場處理2 h后氨基酸總量為10.947 mg/g,其中必需氨基酸的含量為6.518 mg/g,占總氨基酸的59.54%。弱磁場處理胰蛋白酶會影響其氨基酸種類及數量,其必需氨基酸占比上升,氨基酸總量下降。由2.2可知,經弱磁場處理后,胰蛋白酶的活性有一定程度的提高,推測胰蛋白酶的側鏈發生了變性導致氨基酸總量下降而活性上升。

表2 胰蛋白酶氨基酸組成及含量Table 2 Composition and contents of amino acid of trypsin

2.4 弱磁場處理對胰蛋白酶結構的影響

2.4.1 弱磁場處理對胰蛋白酶紅外光譜的影響 蛋白質主鏈的構象主要由酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的特征峰確定,1600～1700 cm-1間為酰胺Ⅰ帶的特征吸收頻率,為蛋白質二級結構變化的敏感區域,是由蛋白多肽骨架的 C=O 伸縮振動引起的,1500～1600 cm-1處為酰胺Ⅱ帶的特征吸收頻率,主要為C-N伸縮振動與N-H彎曲振動的反映,1200～1330 cm-1間的譜帶歸屬于酰胺Ⅲ帶,也由C-N伸縮振動與N-H彎曲振動引起[25]。弱磁場處理前后的紅外光譜如圖3所示,弱磁場未處理時酰胺Ⅰ帶(1600～1700 cm-1)主要吸收峰出現在1651.33 cm-1處,酰胺Ⅱ帶(1500～1600 cm-1)出現在1515.86 cm-1處,而酰胺Ⅲ帶(1200～1330 cm-1)吸收峰出現在1291.97 cm-1處;當弱磁場已處理2 h時酰胺Ⅰ帶(1600～1700 cm-1)主要吸收峰出現在1639.92 cm-1處,酰胺Ⅱ帶(1500～1600 cm-1)出現在1508.72 cm-1處,而酰胺Ⅲ帶(1200～1330 cm-1)吸收峰出現在1286.27 cm-1處;經弱磁場處理后的胰蛋白酶峰值整體藍移,其可能的原因是由于弱磁場處理使胰蛋白酶的分子內部去折疊,氫鍵減少所導致的。也有可能是水中的氫鍵在磁場作用下發生改變,水的電導率隨黏度降低而增加,磁場作用于作為強極性分子的水分子后產生的洛倫茲力導致氫鍵解體或水分子集團的形狀改變,改變水分子的表面張力[26],與酶結合的水分子物化性質的改變最終導致酶構象發生改變。

圖3 弱磁場處理前后胰蛋白酶的紅外光譜 Fig.3 Infrared spectra of trypsin untreated and treated by weak magnetic field

2.4.2 弱磁場處理對胰蛋白酶二級結構的影響 摩爾橢圓率(表示圓二色譜(CD)色性,從圖4可知,通過分析CD圖譜發現,磁場處理前的胰蛋白酶圓二色譜圖在195 nm附近有一個正峰,在208 nm附近有一負峰,說明胰蛋白酶具有由α-螺旋和β類結構構成的高度有序結構,且在208 nm附近的負峰強于195 nm附近的正峰,說明α-螺旋在胰蛋白酶的二級結構組成中占主體地位。而在磁場處理后,胰蛋白酶的圓二色譜發生變化,195和208 nm處的峰值上升,表明胰蛋白酶二級結構中α-螺旋和β-折疊含量發生了增加。通過曲線擬合軟件CD pro計算得到胰蛋白酶在磁場處理前后的二級結構如表3所示,發現在磁場作用下,胰蛋白酶的二級結構同弱磁場未處理組的胰蛋白酶相比,α-螺旋、β-折疊、β-轉角及不規則卷曲都發生了不同程度的改變,其中α-螺旋和β-折疊均發生增加,α-螺旋增加量為5.1%,β-折疊增加了6.0%,β-轉角增加量僅為0.9%,而無規則卷曲則出現減少,減少量為12%。說明弱磁場的處理使得胰蛋白酶二級結構各單元之間發生轉化,即導致胰蛋白酶的構象發生改變。推測其原因可能是磁場處理導致胰蛋白酶分子內部電荷分布發生變化,導致原有維系其螺旋和折疊結構定性的氫鍵取向發生改變,進而導致其二級結構發生改變[27-29]。

表3 弱磁場處理前后胰蛋白酶的二級結構Table 3 Secondary structure of trypsin untreated and treated by weak magnetic field

圖4 弱磁場處理前(A)與磁場處理后(B)胰蛋白酶的圓二色譜Fig.4 Circular dichroism of trypsin untreated(A)and treated(B)by weak magnetic field

3 結論

經弱磁場處理后,胰蛋白酶制得的單位濃度酶解液對各種選擇指示菌的抑菌率均得到提高;經弱磁場處理過胰蛋白酶比未處理胰蛋白酶的酶活高出了52.5 U/min,氨基酸總量下降,必需氨基酸占比上升。胰蛋白酶的紅外吸收峰發生移動,弱磁場處理可能會使胰蛋白酶分子內部去折疊。同弱磁場未處理胰蛋白酶相比,磁場處理胰蛋白酶二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角及不規則卷曲都發生了不同程度的改變,其中α-螺旋和β-折疊均發生增加,無規則卷曲則出現減少,弱磁場處理會對胰蛋白酶的二級結構產生影響。

磁場在一定程度上影響了胰蛋白酶的結構進而影響了酶活性,而酶結構和活性的改變影響了胰蛋白酶的專一性進而導致梅魚蛋白酶解液的抗菌活性得到提高。但是實驗并沒有對胰蛋白酶活性增強和構象變化之間的關系進行深入分析,下一步將通過熒光光譜,核磁共振等具體分析其二級結構以及三級結構的變化,以此來說明其酶學性質變化的機理。