超聲輔助低共熔溶劑提取蘋果葉中的總黃酮

孔 方,李 莉,劉言娟

(臨沂大學(xué),山東臨沂 276000)

中國是蘋果生產(chǎn)大國,產(chǎn)量約為4100多萬噸/年,約占全世界總產(chǎn)量的55%。與此同時(shí),每年會(huì)產(chǎn)生大量的蘋果葉,但這些蘋果葉沒有被充分利用,大多被掩埋或者焚燒,不僅浪費(fèi)了資源而且污染了環(huán)境。而蘋果葉的藥用價(jià)值早有記載,《滇南本草》記載:敷臍上治陰癥,又治產(chǎn)后血迷,經(jīng)水不調(diào),蒸熱發(fā)燒,服之神效;貼火毒瘡或湯火,燒灰調(diào)油搽之最良[1-2]。

已有研究報(bào)道,蘋果葉中含有很多黃酮類化合物[2-3]。該類化合物具有諸多生物活性,主要包括:抗氧化[4-5]、保護(hù)心血管系統(tǒng)[6]、增強(qiáng)免疫[7]、抗腫瘤[8]、降低血糖[9]、抗菌[10]、抗炎[11]、抗病毒[12]、抗過敏[13]等。該類化合物在醫(yī)藥、化妝品、保健品和食品等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用,是目前倍受關(guān)注的天然產(chǎn)物之一。對蘋果葉總黃酮進(jìn)行提取,既能實(shí)現(xiàn)對廢棄資源的利用,也能更好地開發(fā)利用蘋果葉總黃酮。新型低共熔溶劑(DES)是一種由氫鍵受體和氫鍵供體按一定比例混合后于一定溫度下加熱攪拌形成的透明、均一、穩(wěn)定的溶液[14]。具有蒸汽壓低、無毒性、可生物降解、溶解性和導(dǎo)電性優(yōu)良、電化學(xué)穩(wěn)定窗口寬等獨(dú)特的理化性質(zhì),并且DES是多元體系,可以任意組合,更容易選擇適合的組分,在很多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[15-19]。DES在溶解能力方面具有獨(dú)特的性質(zhì),可以有選擇的對無機(jī)或有機(jī)物進(jìn)行溶解,因此,在天然產(chǎn)物提取分離方面具有很好的應(yīng)用價(jià)值。DES已在液液萃取、固相微萃取、高效液相色譜、逆流色譜等領(lǐng)域有較多的應(yīng)用[20-23]。

本研究首先篩選對蘋果葉總黃酮提取效果最佳的DES,研究超聲溫度、超聲時(shí)間等參數(shù)對提取效果得影響,在此基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定超聲波輔助DES提取蘋果葉總黃酮的最佳工藝條件,以期為蘋果葉資源的充分利用提供一定的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果葉 采自山東省淄博市沂源縣,洗凈,于60 ℃烘箱中干燥2 h,粉碎過60目篩,備用;氯化膽堿、對甲酚、三氟乙酸 分析純,阿拉丁試劑有限公司;丙三醇、乙二醇、三乙醇胺、95%乙醇 分析純,天津恒興化學(xué)制劑有限公司;蘆丁 純度98%,中國食品藥品檢定研究院。

KQ-250DB超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;TU-1810SPC紫外可見分光光度計(jì) 北京友儀四方科技有限公司;DF-1集熱式磁力攪拌器 江蘇金壇市金勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;SHK-III型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;AB104電子分析天平 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司;DHG-9035A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海恒科技有限公司;ST-06型300 g多功能粉碎機(jī) 永康市帥通工具有限公司;JIDI-20D臺式高速離心機(jī) 廣州吉迪儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及總黃酮得率的測定 精密稱取蘆丁對照品10 mg,置于50 mL容量瓶中,用70%的乙醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得蘆丁對照品溶液(0.2 mg/mL)。參照文獻(xiàn)[24-25]方法進(jìn)行回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)的考察,具體實(shí)驗(yàn)過程如下:采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法,以蘆丁為對照品,于510 nm下測定吸光度A,以黃酮濃度C為橫坐標(biāo),所測吸光度為縱坐標(biāo),繪制黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)分別為:A=0.0127C-0.0016,R2=0.999。結(jié)果表明,蘆丁對照品溶液在0.008～0.048 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

參照文獻(xiàn)[24-25]方法進(jìn)行得率測定,具體實(shí)驗(yàn)過程如下:精密量取蘋果葉提取液1.5 mL置于25 mL容量瓶中,用去離子水補(bǔ)足至10 mL,加入1 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻放置6 min;再加入1 mL 10%的Al(NO3)3溶液,搖勻放置6 min;最后加入4%的NaOH溶液10 mL,用去離子水定容,搖勻放置15 min,以蘆丁為對照,于510 nm下測定吸光度,計(jì)算蘋果葉總黃酮得率,計(jì)算公式如下:

式中:C:樣品溶液測得吸光度所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度,mg/mL;V1:樣品溶液顯色并定容后的體積,mL;V2:蘋果葉總黃酮提取液的總體積,mL;V3:測吸光度時(shí)所吸取樣品溶液的體積,即用于顯色的樣品溶液體積,mL;m:蘋果葉粉末質(zhì)量,g。

1.2.2 蘋果葉總黃酮的提取 稱取一定量的蘋果葉粉末,按一定的液料比向其中加入具有一定含水量的DES,于超聲波萃取儀中在超聲功率為120 W時(shí),按照一定的超聲溫度,超聲一段時(shí)間。待蘋果葉提取液冷卻至室溫后,在6000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,棄去蘋果葉殘?jiān)?按上述條件重復(fù)離心兩次,收集上清液,即得蘋果葉總黃酮提取液。

1.2.3 DES的優(yōu)化

1.2.3.1 DES的制備 將氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/丙三醇、氯化膽堿/三氟乙酸、氯化膽堿/對甲酚、氯化膽堿/三乙醇胺分別按摩爾比1∶2混合于圓底燒瓶中,在80 ℃油浴鍋中攪拌1.5 h,直至形成透明均一的液體,所得產(chǎn)物即為DES。

1.2.3.2 DES組成體系的選擇 固定提取劑與蘋果葉粉末的液料比30∶1 mL/g、DES含水量10%、超聲溫度70 ℃、超聲功率120 W和超聲時(shí)間30 min,改變DES種類對蘋果葉進(jìn)行超聲提取,提取液用“1.2.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行含量測定,確定最優(yōu)DES組成。

1.2.3.3 DES含水量的選擇 利用“1.2.3.2”中篩選出的最優(yōu)DES,配制成DES含水量分別為0、10%、20%、30%、40%和50%的提取溶劑,固定液料比30∶1 mL/g、超聲溫度70 ℃、超聲功率120 W和超聲時(shí)間30 min,對蘋果葉進(jìn)行超聲提取,提取液用“1.2.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行含量測定,確定提取效果最佳時(shí)的DES含水量。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 液料比對蘋果葉總黃酮得率的影響 以氯化膽堿和三氟乙酸摩爾比1∶2制備DES,調(diào)節(jié)其含水量為30%,蘋果葉粉末與DES提取溶劑的液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1 mL/g,在超聲功率為120 W,超聲溫度為70 ℃下超聲提取30 min,計(jì)算蘋果葉總黃酮得率,考察液料比對蘋果葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.2 超聲溫度對蘋果葉總黃酮得率的影響 以氯化膽堿和三氟乙酸摩爾比1∶2制備DES,調(diào)節(jié)其含水量為30%,按蘋果葉粉末與DES提取溶劑的液料比為20∶1 mL/g,超聲功率為120 W,在超聲溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃下超聲提取30 min,計(jì)算蘋果葉總黃酮得率,考察超聲溫度對蘋果葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.3 超聲時(shí)間對蘋果葉總黃酮得率的影響 以氯化膽堿和三氟乙酸摩爾比1∶2制備DES,調(diào)節(jié)其含水量為30%,蘋果葉粉末與DES提取溶劑的液料比為20∶1 mL/g,在超聲功率為120 W,超聲溫度為70 ℃條件下,分別超聲提取10、15、20、30、40和50 min,計(jì)算蘋果葉總黃酮得率,考察超聲時(shí)間對蘋果葉總黃酮得率的影響。

1.2.5 BBD設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以液料比(X1)、超聲溫度(X2)、超聲時(shí)間(X3)3個(gè)因素作為變量,利用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件,以-1、0、1代表變量水平,進(jìn)行BBD設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)方案,獨(dú)立變量的真實(shí)值與編碼水平見下表1。

表1 BBD設(shè)計(jì)的因素水平Table 1 Factor level of BBD design

本實(shí)驗(yàn)選擇3因素3水平的BBD結(jié)合響應(yīng)面對試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,以此來考察液料比(X1)、超聲溫度(X2)、超聲時(shí)間(X3)3個(gè)因素不同水平組合下對黃酮得率的影響。總黃酮得率的二階多元回歸方程如下式所示:

式中,Xi,Xj表示獨(dú)立的變量,Y表示響應(yīng)變量,β0表示常數(shù),βi表示一次項(xiàng)系數(shù),βii表示二次項(xiàng)系數(shù),βij表示交互項(xiàng)常數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)平均進(jìn)行3次。本研究利用Origin 8.5軟件進(jìn)行做圖,采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差顯著性處理和分析,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DES的確定

2.1.1 DES種類對蘋果葉總黃酮得率的影響 提取溶劑對得率有很大的影響作用。不同溶劑因理化性質(zhì)不同,提取所用時(shí)間以及所得得率也不同,因此選擇合適的溶劑有利于有效成分的高效提取。本研究比較了5種DES對蘋果葉總黃酮的提取效果,結(jié)果如下圖1所示。

圖1 DES種類對蘋果葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of DES on the yield of total flavonoids from apple leaves注:1為氯化膽堿/乙二醇;2為氯化膽堿/丙三醇;3為氯化膽堿/三氟乙酸;4為氯化膽堿/對甲酚;5為氯化膽堿/三乙醇胺。

由圖1可知,由氯化膽堿/三氟乙酸制備的DES對蘋果葉總黃酮的得率最高,可達(dá)4.8%。這可能是由于氯化膽堿/三氟乙酸制備的DES具有較低的粘度,擴(kuò)散系數(shù)比較大,流動(dòng)性好,對細(xì)胞壁具有更好的滲透性,從而能實(shí)現(xiàn)對蘋果葉總黃酮較好的提取效果。由氯化膽堿/乙二醇和氯化膽堿/丙三醇制備的DES粘度較大,對細(xì)胞壁的滲透性較差,所以對目標(biāo)物的提取效果不理想。有研究表明,酚對位取代基的推電子性能夠增強(qiáng)由氯化膽堿/酚所制備DES的氫鍵相互作用,從而導(dǎo)致體系的密度、黏度增加[26],因此,氯化膽堿/對甲酚DES的密度和粘度均較高,擴(kuò)散性和流動(dòng)性均較差,從而對細(xì)胞壁的滲透性不好,對目標(biāo)物的提取效果差。本研究推測由氯化膽堿/三乙醇胺制備的DES可能由于自身組成和結(jié)構(gòu)的原因?qū)е缕渑c目標(biāo)物之間的作用力很弱,故對目標(biāo)物的提取效果最差。因此,本研究選用氯化膽堿/三氟乙酸制備的DES進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 DES含水量對蘋果葉總黃酮得率的影響 DES可與水互溶,水可以改變DES的張力、極性和粘度等性質(zhì)。一定的含水量能降低DES的粘度,同時(shí)由于水的加入使得被提取物質(zhì)膨脹,使提取溶劑更容易滲透到植物細(xì)胞內(nèi)部增大溶劑與被提取物質(zhì)的接觸面積,從而使其對目標(biāo)物的提取更有利。

本研究改變DES含水量,考察其對總黃酮得率的影響,結(jié)果如下圖2所示。由圖2可知,隨著DES含水量的增大,蘋果葉總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,在含水量為30%時(shí)得率最高。這是由于含水量在一定范圍內(nèi)增大時(shí)可降低DES粘度,使其更有利于滲透進(jìn)細(xì)胞,所以得率隨之上升。達(dá)到最大值以后,含水量繼續(xù)增加使得組成DES的兩個(gè)組分濃度過低,兩者之間不能形成氫鍵進(jìn)而打破了DES體系,溶劑的理化性質(zhì)被大大改變,越來越接近水的性質(zhì),使得率明顯下降,因此本實(shí)驗(yàn)選取含水量為30%的氯化膽堿/三氟乙酸作為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 DES含水量對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of DES water content on yield of total flavonoids

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對蘋果葉總黃酮得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,在液料比小于20∶1時(shí),蘋果葉總黃酮得率隨液料比的增大而呈上升趨勢,20∶1時(shí)蘋果葉總黃酮得率最大,之后開始下降。推測溶劑量的增加使物料與溶劑接觸面積、溶液傳質(zhì)推動(dòng)力均增大,濃度梯度變大,有利于黃酮的溶出,從而使其溶出速度和得率變大;而當(dāng)溶劑增加過多時(shí),大量溶劑的存在會(huì)消耗超聲波的能量,使超聲的效率下降,不能有效的擊穿細(xì)胞,使有效物質(zhì)的釋放減少,造成黃酮得率下降。因此,本研究選擇20∶1 mL/g為最佳液料比。

圖3 液料比對蘋果葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids from apple leaves

2.2.2 超聲溫度對蘋果葉總黃酮得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖4所示,在小于70 ℃的區(qū)間內(nèi),蘋果葉總黃酮得率隨溫度的升高而增大,在70 ℃時(shí),黃酮得率達(dá)到最大值,再繼續(xù)升高溫度時(shí)黃酮得率開始下降。隨著溫度的升高,一方面會(huì)使DES的粘度降低,另外DES的能量也增加,促進(jìn)溶劑進(jìn)入組織細(xì)胞,加速有效成分的釋放;當(dāng)達(dá)到適宜值后,溫度升高得率反而下降,這是由于溫度過高會(huì)使黃酮類成分結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞,從而使得率有所下降。因此,選擇超聲溫度為70 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 超聲溫度對蘋果葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound temperature on the yield of total flavonoids from apple leaves

2.2.3 超聲時(shí)間對蘋果葉總黃酮得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖5所示,隨著超聲時(shí)間的延長,黃酮得率逐漸增大,以30 min為分界點(diǎn),大于30 min后黃酮得率反而隨著時(shí)間的延長而降低。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是:時(shí)間延長,植物組織中的有效成分不斷溶出,得率增加,到一定時(shí)間時(shí),得率達(dá)到最高;提取時(shí)間繼續(xù)延長,得率開始下降,這是因?yàn)殚L時(shí)間提取時(shí),非黃酮類物質(zhì)溶出增加,并且長時(shí)間超聲可能會(huì)導(dǎo)致已溶出的黃酮類化合物發(fā)生分解。另外,超聲時(shí)間越長造成的能耗越大,使提取成本大幅度增加,本研究選擇30 min為最佳超聲時(shí)間。

圖5 超聲時(shí)間對蘋果葉總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasound time on yield of total flavonoids from apple leaves

2.3 超聲輔助DES提取蘋果葉總黃酮的工藝優(yōu)化

2.3.1 BBD與響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果Table 2 Response surface design experiments and results

表3 響應(yīng)曲面二次模擬方差分析Table 3 Response simulation surface quadratic simulation analysis of variance

利用Design-Expert 8.0.6軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,得到總黃酮得率(Y)對以上3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型:

2.3.2 響應(yīng)曲面分析 響應(yīng)曲面的陡峭程度及等高線形狀反映兩因素交互作用的顯著程度,曲面越陡峭,等高線越接近橢圓,則兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響顯著;陡峭程度越小,等高線越近于圓形,則表示兩因素交互作用對響應(yīng)值無顯著性影響,各因素之間的交互影響直觀效果如下圖6～圖11所示。

如圖6～圖7所示,響應(yīng)曲面相對平緩,等高線接近于圓形,說明提取溫度和液料比的交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著。黃酮得率隨提取溫度和液料比的遞增先增加后減少,提取溫度對總黃酮得率的影響大于液料比的影響。

圖6 液料比-超聲溫度兩因素交互作用對總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the effect of liquid-solid ratio and ultrasound temperature interaction on the yield of total flavonoids

圖7 液料比-超聲溫度兩因素交互作用對總黃酮得率影響的等高線圖Fig.7 Contour map of the effect of liquid-solid ratio and ultrasound temperature interaction on the yield of total flavonoids

如圖8～圖9所示,曲面陡峭,等高線形狀接近橢圓,說明超聲時(shí)間和液料比的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著,曲面坡度說明液料比對于蘋果葉總黃酮得率的影響大于超聲時(shí)間。

圖8 液料比-超聲時(shí)間兩因素交互作用對總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of the effect of liquid and solid ratio and ultrasound time interaction on the yield of total flavonoids

圖9 液料比-超聲時(shí)間兩因素交互作用對總黃酮得率影響的等高線圖Fig.9 Contour map of the effect of liquid-solid ratio and ultrasound time two-factor interaction on the yield of total flavonoids

如圖10～圖11所示,曲面陡峭,等高線形狀近似橢圓,說明超聲溫度和超聲時(shí)間的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著,且曲面坡度表明超聲溫度對于蘋果葉總黃酮提取率的影響大于超聲時(shí)間的影響。

圖10 超聲溫度-超聲時(shí)間兩因素交互作用對總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface diagram of the effect of ultrasound temperature and ultrasound time interaction on the yield of total flavonoids

圖11 超聲溫度-超聲時(shí)間兩因素交互作用對總黃酮得率影響的等高線圖Fig.11 Contour map of the effect of ultrasound temperature-ultrasound time interaction on the yield of total flavonoids

2.3.3 最佳工藝條件的確定 通過Design-Expert 8.0.6軟件,依據(jù)數(shù)學(xué)回歸模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化,得出最佳工藝參數(shù)為液料比22.84∶1 mL/g,超聲溫度為72.14 ℃,超聲時(shí)間為26.53 min,預(yù)測總黃酮得率為7.23%。

為驗(yàn)證分析結(jié)果的可行性與可靠性,選取液料比23∶1 mL/g,超聲溫度72 ℃,超聲時(shí)間27 min,進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),蘋果葉總黃酮得率為7.06%,實(shí)際得率與預(yù)測得率相差2.35%,二者非常接近,表明該優(yōu)化條件準(zhǔn)確可靠。

3 討論

本研究以DES為提取溶劑對廢棄蘋果葉中的總黃酮進(jìn)行超聲輔助提取,確定了提取效果最佳的DES為氯化膽堿/三氟乙酸,最佳含水量為30%。響應(yīng)面結(jié)果表明,超聲輔助提取蘋果葉總黃酮的最佳工藝條件為:液料比23∶1 mL/g、超聲溫度72 ℃、超聲時(shí)間27 min,按照該工藝進(jìn)行提取,蘋果葉總黃酮的平均得率為7.06%。研究結(jié)果表明,具有一定含水量的DES對黃酮類化合物具有較好的溶出效果,可將其應(yīng)用于黃酮及其他天然產(chǎn)物的提取中。超聲輔助DES提取蘋果葉總黃酮具有操作簡單、成本低、綠色環(huán)保等特點(diǎn),本研究能為廢棄蘋果葉的開發(fā)利用提供一定的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。